HPLC色谱分析对于研发及生产瑞德西韦及其他抗病毒药物的意义

文章中提到的瑞德西韦（Remdesivir），又被称作GS-5734，是由美国吉利得科学公司（Gilead Sciences）研发出的一款核苷类似物抗病毒药物。据2017年发表于Journal of Medicinal Chemistry上的一篇文章指出*，在超过20年跨越多个抗病毒项目的研究中，由于其在多个细胞系中展现出的高效力以及合成工艺中可以快速放大的特性，GS-5734从近1000个不同核苷及核苷磷酸酯的药品库中脱颖而出。

来自Drug Bank

核苷类似物通过细胞内核苷激酶激活产生其各自的核苷三磷酸（NTP）代谢产物。具有药理学活性的三磷酸核苷（NTP）之后与内源性天然核苷酸库竞争，从而掺入复制的病毒RNA中，并充当RNA链终止剂。由于产生核苷单磷酸的第一步磷酸化通常是限速步骤，因此单磷酸酯前药，特别是氨基磷酸酯，在核苷类似物的筛选中被广泛研究。从结构上来说，瑞德西韦就是由核苷类似物单磷酸化而得到，并且其中的1'-CN基团和C连接的核碱基对于选择性对抗宿主聚合酶至关重要。

该文章提出了一条更加有效的母体化合物合成路线。通过关键试剂的结晶来制备单一Sp非对映异构体 GS-5734，从而进行体内模型的研究。其中HPLC被用于合成过程中的纯度评估。文章所使用的色谱柱为Phenomenex Kinetex C18, 2.6 μm, 100 × 4.6 mm （货号：00D-4462-E0）。在流动相A为0.1% TFA水溶液，流动相B为0.1% TFA乙腈溶液，流速1.5 mL/min的条件下进行了2%流动相B到98%流动相B的梯度淋洗。Kinetex的核壳结构保证了进行纯度评估时更窄的峰形，以及更短的运行时间。

同时，配备着Phenomenex Gemini 5 μm C18 30×4.6mm（货号：00A-4435-E0）色谱柱的 LC-MS也被用于在合成中监测反应进程。在进行不同前药及中间体合成的过程中，HPLC制备色谱柱以及硅胶固定相的Flash色谱柱被大量使用来进行化合物的纯化分离。

除了非手性色谱柱外，在第一代合成方法中，由于合成的化合物4a是1：1的Sp4b（GS-5734）和Rp4c两种非对映异构体的混合物，因此需要通过手性分离柱Phenomenex Lux Cellulose-2在极性有机分离模式下将其分离。其色谱运行条件为95%乙腈/5%甲醇等度洗脱。其中4c为第一洗脱物，4b（GS-5734）为第二洗脱物。

可以看出，如果没有高效液相色谱HPLC的辅助，前药和中间体的合成及分离将面临挑战。

除了在前药合成及分离方面的应用，高效液相色谱HPLC在细胞层面以及药代动力学分析中都发挥了重要作用。2016年发表于《自然》（Nature）上的文章 “Therapeutic Efficacy of the Small Molecule GS-5734 against Ebola Virus in Rhesus Monkeys”（小分子GS-5734在恒河猴体内抗埃博拉病毒的治疗作用）中，描述了GS-5734（瑞德西韦）在细胞内代谢的研究。为了测定Ala-Met（丙氨酸代谢物），Nuc（核苷），NMP（单磷酸核苷），NDP（二磷酸核苷），以及 NTP（三磷酸核苷）的含量，Phenomenex Luna C18(2) HST, 2.5μm, 50×2.0 mm（货号：00B-4446-B0）色谱柱，配合API 4000 MS/MS在含有离子对试剂10 mM二甲基己胺以及3 mM甲酸铵（pH 5.0）的流动相条件下，以150 μL/min的流速在8分钟内从10% 乙腈淋洗到50% 乙腈。

在药代动力学分析中，三只未感染的雄性恒河猴在给药之后，等分血浆试样经过甲醇乙腈混合物进行蛋白沉淀，加入内标，并重新溶解在含有1% 乙腈，99% 水以及0.01% 甲酸的溶液中。Phenomenex Synergi Hydro-RP, 4 μm,75 × 2.0 mm（货号：00C-4375-B0）色谱柱在0.26 mL/min的流速下，在4.5分钟的运行时间内从含有99% 水，1% 乙腈以及0.2% 甲酸的流动相A梯度淋洗到含有95% 乙腈，5% 水和0.2% 甲酸的流动相B。

此项研究在发表于2017年的“Broad-spectrum antiviral GS-5734 inhibits both epidemic and zoonotic coronaviruses“*（广谱抗病毒GS-5734抑制流行性和人畜共患的冠状病毒）中也有所提及。

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