Diabetes Care: 高覆盖率靶向脂质组学揭示2型糖尿病新的血脂预测因子

糖尿病已成为全世界死亡和残疾的主要原因。近几十年来，中国糖尿病患病率翻了两番多。据估计，2013年中国成年人中有10.9%患有糖尿病，35.7%患有前驱糖尿病。对糖尿病的生物标志物或新的途径失调预测的鉴定是一个研究热点。

近几十年来，组学的出现为临床医生提供了一个新的途径，以前所未有的分辨率和覆盖率来检查与疾病相关的代谢物变化，使人们对糖尿病等疾病复杂的病理生理学有了进一步的了解。脂质组学作为代谢组学的一个独立子领域，有越来越多的研究探讨了脂质代谢失调与2型糖尿病(T2DM)发病机制的关系。

近日，国家代谢病临床研究中心、上海内分泌与代谢病研究所、上海交通大学医学院附属瑞金医院、中国科学院遗传与发育生物学研究所等单位研究人员在《Diabetes Care》上发表了题为“高覆盖率靶向脂质组学揭示了中国血糖正常的成人2型糖尿病发病前的新血脂预测因子和脂质通路失调”的研究论文，评估了糖耐量正常个体T2DM发病前脂质协同调节的变化，并确定新的T2DM的脂质预测因子。“上海交通大学医学院附属瑞金医院陆洁莉医生和中科院遗传发育所客座研究人员Lam Sin Man博士（中科脂典技术总监） 为本文的共同第一作者”，上海交通大学医学院附属瑞金医院王卫庆主任和中科院遗传发育所税光厚研究员为本文的共同通讯作者。

大多数已有的关于糖尿病血液（血清/血浆）的脂质组学研究没有达到令人满意的覆盖率，无法呈现脂质代谢通路紊乱；而最近的脂质组学研究中，仅使用一种内标就定量207种血浆脂质，这可能会显着地损害脂质组定量准确性。考虑到人类血清脂质组的巨大复杂性，有限的脂质组学覆盖可能阻碍对T2DM发病基础上的细微脂质通路扰动的公正评估。本文章的研究人员采用了一种高覆盖率的靶向脂质组学方法，该方法主要构建在高效液相色谱和多重反应监测(HPLC-MRM)的基础上，同时提供了对内源性脂质代谢稳态至关重要的基本脂类的精确定量和广泛覆盖。

此外，之前的脂质组学研究主要是用基线血糖调节正常(NGR)或糖调节受损(IGR)的混合群体进行的，这使得很难分析这些已发现的脂质变化是早期血糖异常的先兆，还是血糖异常发生在这些脂质变化之前。在此，研究人员采用嵌套病例对照设计，广泛研究了两组中国前瞻性人群（NGR群体）血清脂质变化，以确定新的标志物和途径，并可能提高临床危险因素以外的T2DM发病率预测。

在发现队列中，除了性别、年龄、体重指数和空腹血糖（FPG）符合倾向评分匹配（PSM），基线特征包括空腹高密度脂蛋白（HDL）胆固醇、低密度脂蛋白（LDL）胆固醇、胰岛素水平、收缩压（SBP）、糖尿病家族史和生活方式因素，包括吸烟、饮酒、体育活动和教育状况病例和对照组也很匹配。在发现队列中，病例组显示2小时后血糖（2hPG）和空腹甘油三酯（TG）水平较高。在验证队列中，病例组的SBP和空腹TGs明显高于对照组（表1）。

表1.从发现和验证队列中选择的嵌套病例对照的基线特征

在剔除未满足信噪比（S / N <3）的质谱峰后，在发现队列研究（n = 200）的血清脂质组中鉴定并定量了来自24大类总共667种脂质（筛选自超过800种脂质的靶向库中）。统计分析显示有122种候选类脂可以将糖尿病患者与健康对照者分离开来。基于发现队列的结果，采用包含250个具有重要意义的脂质子库的简化方法来分析验证队列的血清脂质组。

在多变量logistic回归分析中，经年龄、性别、身体质量指数（BMI）、FPG、吸烟、饮酒、教育程度、体育锻炼、糖尿病家族史、SBP等因素调整后，在发现队列与验证队列中，病例组与对照组均有38种血脂(FDR<0.05, P<0.05)，在统计学上有差异 (图1)。该小组包含34个TAGs，横跨了全面的碳原子数（C44-C58）和不饱和度（n[C=C]=0-8），与T2DM风险增加相关。此外，短链CEs (CE14:0)、二不饱和PCs (PC34:3)、LPI16:1与T2DM风险呈正相关，而多不饱和缩醛磷脂PE即PE38:4p (18:0p/20:4)与糖尿病发病风险呈负相关（图1）。

图1. 脂质分析和糖尿病发病风险

研究人员系统地研究了与糖尿病风险相关的脂质模式，这些模式依赖于所研究的各种脂质类别的碳原子数和双键。基于碳原子数和不饱和度的统计显著变化（P<0.05）仅在TAGs发现。由于在碳原子数和双键上的全面覆盖率，选择发现队列用于这一目标。所有的血清TAGs检测显示，无论碳原子数（C44-C60）和双键数（n[C= C]=0-9）多少，它与糖尿病风险呈正相关（P＜0.05）。然而，校正总的TAGs后，只有低碳原子数(C48-50)和低双键数目(n [C=C] =2-3)显著(P < 0.05)与糖尿病风险升高相关,而TAGs的高碳原子数(C54-60)或双键数目(n [C=C] > 4) (P < 0.05)与糖尿病风险呈负相关（图2）。

图2. 糖尿病风险与总碳数及不同脂

接下来，研究人员从发现队列中随机抽取87名IGR群体和87名NGR群体，进行了为期4.4年的随访，初步研究了图1中的脂质与IGR发展的关系（补充图1）。发现38种已识别的脂类中有26种与IGR风险有显著相关性(P<0.05)。大多数已识别的TAGs，以及CE14:0和PC34:3，也与IGR的风险呈正相关，而PE38:4p (18:0p/20:4)与IGR呈负相关（补充图3）。

补充图1. 示意图说明所采用的研究设计

补充图3. 脂图谱与糖调节受损风险(IGR)

为了确定糖尿病独立的脂质预测因子，研究人员将脂质逐一纳入条件logistic回归模型，并进一步校正TG和2hPG。38种脂质中有6种达到了标称显著性(P<0.05)，包括LPI16:1、PC34:3、PE38:4p (18:0p/20:4)、TAG50:2(16:2)、TAG51:0(17:0)、TAG54:7(22:6)(图3A)。然后，研究人员利用ROC分析评估了这六种确定的脂质的预测价值。从参考模型中去除了匹配因子。在发现队列和验证队列中，当将脂质添加到已建立的糖尿病风险预测模型中时，辨别力都明显提高（图3B）。

图3. 在发现和验证队列中，选择用于糖尿病风险预测的脂质的多变量逻辑回归模型

为了系统评价糖尿病发展过程中脂质协同调控的扰动，研究人员基于验证队列进行了多尺度嵌入相关分析。多尺度嵌入相关网络表明，与对照组相比，糖尿病患者的各种脂质之间存在差异相关性（图4）。与对照组相比，在糖尿病患者中PUPA-Pep如PE40:5p (22:5)与TAGs呈负相关；对于脂肪酰基不饱和，血清TAGs类内协同调节变得越来越分离。综合来看，差异相关网络显示，甚至在糖尿病发病之前，类内(即non-PUFA TAGs和PUFA-TAGs)以及类间(即TAGs和PUFA- PEps)的脂质协同调控就已经存在。

图4. 多尺度嵌入式相关网络分析

在这项前瞻性研究中，利用高覆盖率的靶向LC-MRM脂质组学方法，研究者在一个发现队列中提出了T2DM的血清脂质预测因子，并将这些发现复制到正常血糖中国成年人的前瞻性队列中；发现这些脂质大大改善了T2DM预测的常规临床危险因素。此外，研究者揭示了在前驱糖尿病葡萄糖紊乱开始之前，不同碳原子数和不饱和度的TAG之间的类内共调节，以及PUFA-PEps和TAG之间的相关性便发生了变化。然而，该项研究也有一些局限性。首先，随访持续时间只有四年，这将研究者确定的脂质组的预测潜力限制在相对较窄的时间窗口；其次，可能影响循环脂质的基线水平的食物消费习惯在当前模型中不受控制，因为参与者的饮食信息缺乏；第三，由于病例和对照的BMI和年龄按照PSM匹配，因此参考模型的区分必须由其他包含的风险因素（例如，家族史，甘油三酯）驱动，因此预测值可能已经受到PSM的影响；第四，胰岛素抵抗和胰岛素分泌没有在这些队列中评估；第五，本研究的对象都是中国人，因此需要进一步的工作来确定研究结果是否可以推广到其他种族和民族。但这些局限并不影响该研究为目前已发表的研究基线时NGR患者的脂质谱与糖尿病发病风险之间的关系的最大和最全面的脂质组学研究。原文链接