● 期刊：Environ Toxicol Pharmacol
● IF：4.86
● 发表时间：2021.05
前言：
临床研究表明，肝内胆汁淤积与肠道损伤密切相关。肠肝轴理论认为肠和肝密切相关，胆汁酸是连接肠和肝的重要介质。近期，广州中医药大学熊天琴团队与西藏藏医药大学泽仁达瓦团队共同在Environmental Toxicology and Pharmacology（环境毒理学与药理学）期刊上发表最新研究结果“ Intrahepatic cholestasis induced by α-naphthylisothiocyanate can cause gut-liver axis disorders”，迈维代谢在此次研究中提供了粪便样本中的胆汁酸检测和分析服务。
研究背景
α-萘基异硫氰酸酯 (ANIT) 是一种常规的胆汁淤积建模剂，可对肝脏的小胆管造成炎症性损伤，并诱导肝内胆汁淤积损伤肝细胞 。其损伤特征类似于临床原发性胆汁性胆管炎（PBC）。PBC 可导致肠绒毛缩短、乳糜泻和肠道菌群失衡。但PBC引起肠道损伤的机制尚不清楚。
肠肝轴理论声称多种介质连接肠道和肝脏，胆汁酸是这些必需介质之一。胆汁酸通过胆汁酸受体（例如法尼醇 X 受体 (FXR) 介导的多种胆汁酸蛋白）实现胆汁酸肝脏循环，以维持正常的肝脏和肠道功能。
粪便中胆汁酸组成的变化与肠道损伤密切相关。一些胆汁酸对肠道具有细胞毒性。例如，鹅去氧胆酸 (CDCA) 可诱导肠道氧化和炎症损伤，而牛磺胆酸 (TCA) 也已被证明与肠道炎症有关。
研究设计
这项研究比较了两种胆汁淤积模型：接受单次皮下注射 ANIT (75 mg/kg) 的单次注射模型，以及每隔一天注射一次 ANIT (50 mg/kg) 持续 2 周的多次皮下注射模型。使用 Transmetil（腺苷蛋氨酸 1,4-丁二磺酸盐）来缓解多次注射组的肝内胆汁淤积。实验设计如下图：
研究结果
1.多次和单次注射ANIT致肝功能障碍
将ANIT溶解在橄榄油中，多剂量和单剂量的橄榄油对肝脏没有显著的毒性。
单次注射组肝脏出现炎症浸润和胆管增生。多次注射组炎症浸润、胆管增生更为明显(图1A)。与对照组相比，单次注射组和多次注射组血清ALT、AST、AKP和TBA水平均显著升高(图1 B-D)。
图1.多次和单次ANIT皮下注射导致的肝功能损伤
2.多次和单次注射ANIT致肝纤维化
单次注射组胆管增生周围出现胶原沉积。这些结果提示，多次皮下注射ANIT引起的纤维化比单次注射ANIT引起的纤维化更严重(图2A)。
纤维化因子方面，与对照组相比，单次注射组肝纤维化标志物αSMA显著降低，多次注射组显著升高。)另一种肝纤维化标志物——细胞角蛋白19 (CK-19，在单次和多次注射组均升高(图2B)。Timp1在单次和多次注射组均显著升高，且多次注射组Timp1水平高于单次注射组。与对照组和单次注射组相比，多次注射组Mmp13和Mmp2水平显著升高(图2 C-F)。
肝脏炎症反应方面，Tgfβ1、Il-1β、Il-18 mRNA水平在单次和多次注射组均高于对照组，两组间差异无统计学意义。多次注射组TGFβ1蛋白水平明显高于对照组；然而，单次和多次注射组在这方面没有显著差异(图2 H-J)。
图2.多次和单次皮下注射引起的肝脏炎症和纤维化损伤
3.多次和单次注射ANIT致肠屏障损伤
单次注射组和对照组肠道结构完整；而多次注射组小肠绒毛明显缩短。
与对照组相比，单次注射组肠道紧密连接蛋白ZO- 1、Occludin差异无统计学意义，但多次注射组小肠中ZO-1、Occludin和的表达降低(图3)。
图3.多次和单一ANIT皮下注射导致的小肠屏障损伤和紧密连接蛋白的表达
4.多次和单次注射ANIT引起的肠道氧化和炎症损伤
与对照组相比，单次和多次注射组小肠中的 IL-1β、IL-10 和 IL-6的mRNA水平较高。尽管对照组和单次注射组的 IL-1β 蛋白水平没有差异，但多次注射组的水平明显更高。这表明多次注射 ANIT 会导致小肠更明显的炎症损伤（图 4 A-D）。
单次和多次注射组小肠抗氧化指标GSH和GSH/GSSG均降低，而多次注射组SOD水平降低，MDA水平升高，提示多次皮下注射ANIT可能导致肠道抗氧化能力降低和氧化剂增加（图 4 E-J）。
图4.多次和单次ANIT皮下注射引起的小肠炎症和氧化损伤
5.多次和单次注射ANIT引起的粪便胆汁酸紊乱
单次注射组粪便中胆汁酸各组分均有所下降，而多次注射组部分胆汁酸成分有所增加(多次注射组中毒性胆汁酸TCA、TLCA明显升高)（图 5 A-C）。
与对照组和单次注射组相比，多次注射组的胆汁酸受体 Tgr5 增加。同时，多次注射组Fxr和Abst均降低，说明多次注射ANIT后肠道胆汁酸调节受到干扰。特别是肠道屏障的重要调节剂 Fxr 在多次注射组中显着降低（图5. D-F）。
图5.ANIT多次和一次皮下注射后粪便胆汁酸组成的差异和胆汁酸蛋白的变化
6.ANIT诱导肝内胆汁淤积缓解后肠肝轴恢复
Transmetil 由腺苷蛋氨酸 1,4-丁二磺酸盐组成，其在体内代谢为 S-腺苷-L-甲硫氨酸 (SAME)。SAME对胆汁淤积有明确的治疗作用，但其对胆汁淤积中肠肝轴损伤的作用尚不清楚。作者使用 Transmetil 来缓解肝内胆汁淤积，治疗剂量的Transmetil 对肝脏没有显着毒性。
为了观察肠-肝轴的改善，作者们着重观察多次注射的效果。用 Transmetil 治疗后，胆管增生（图 6A）和 ALT、AST、AKP、TBA（图 6B-E）和 TGF-β1（图 6F）的水平降低。胆汁酸受体FXR上调（图 6 H）。Transmetil治疗后回肠绒毛缩短得到改善（图6I），GSH、GSH/GSSG增加，GSSG降低（图6J-L），小肠IL-1β降低（图6M），回肠FXR增加（图 6 N）。
图6.Transmetil治疗后，ANIT诱导的肠肝轴紊乱恢复
研究结论
多次皮下注射ANIT引起的肝内胆汁淤积会导致更严重的肝纤维化、肠屏障损伤、肠氧化、炎症损伤。其机制可能与粪便中胆汁酸组成的改变及回肠FXR的改变有关。胆汁酸与细菌的相互作用，可能进一步阐明胆汁淤积致肠道损伤的机制。
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