Anal Chem | 质谱成像可快速识别早期缺血性肾脏损伤

● 期刊：Anal Chem

● 发表时间：2019.03

● 影响因子：6.78

概述

急性肾损伤是一种严重的疾病，具有高发病率和死亡率。目前没有可靠的评估急性肾损伤严重程度的方式。因此，开发新的工具来快速准确地评估急性肾脏缺血在重症监护中具有重要性。本文研究了质谱成像技术在猪模型中评估急性缺血肾组织的价值。组织病理学检查显示肾脏之间没有显著差异，而MALDI-MSI能够检测肾脏组织2h内特征性脂质降解产物的差异表达来详细区分肾脏严重和轻度缺血。这项研究证明了MSI在临床可接受的时间范围内区分和识别早期缺血性损伤的巨大潜力。

1.获取肾脏及建立缺血模型

本文使用成对的猪肾模型来区分肾脏缺血性损伤。我们旨在开发一种可以推广到临床移植的系统，在这种系统中，具有热缺血(即供体中)和冷缺血(即运输过程中)的已故供体的肾脏被越来越多地使用。肾脏是从当地一家屠宰场的八头猪身上获得的。一只猪的两个肾在死后15分钟通过电击和放血同时获得。移除肾周脂肪，解剖肾动脉，插入导管，并连接到输液袋。死后25分钟，用冷组氨酸色氨酸酮戊二酸保存液在0-4℃冲洗肾脏20分钟。灌注的开始被记录为热缺血时间的结束和冷缺血时间的开始。同时，使用冷氯化钠溶液进行局部冷却。此后，将两个肾脏储存在装有氯化钠溶液的袋子中，并放置在装有冰的聚苯乙烯泡沫盒中，以便运输到实验室。在实验室，肾脏从冷藏中取出，在CIT 3小时后，使用两个Lifeport肾脏转运蛋白，同时开始低温机器灌注(HMP)。肾脏在4°C低温灌注1小时。8对肾脏中的7对被随机分配到两种灌注类型中的一种:HMP在4°C(冷或轻度缺血)下灌注4小时，或在28°C机器灌注(SNMP) (热或严重缺血)下灌注4小时。其中一对随后不灌注，直接活检，作为对照组织。

2.组织活检的组织病理学评分

FFPE组织切片4 μm，每肾切片2次。随后，根据标准程序，用苏木精和伊红(H&E)或PAS-D进行染色。使用光镜对所有活检进行了组织病理学检查。对于每个组织切片，在200×放大镜下评估10个包含至少1个肾小球的肾皮质随机区域并进行评分。与缺血性损伤相关的五个参数:管状细胞坏死、刷状边缘缺失、水肿、管状管型和管状上皮细胞的泡。将各参数得分相加，得到损伤总分。

3.质谱成像分析

MALDI- MSI数据在Bruker rapifleX MALDI Tissuetyper上检测获取。

二、实验结果

NO.1 缺血严重程度与机器灌注标记物有关，与组织学无关。

灌注开始10分钟后，HMP和SNMP肾脏的灌注液中乳酸水平没有差异。随着时间的推移，与HMP肾脏相比，SNMP肾脏的乳酸排出量显著更高。作为SNMP肾脏增加缺血性损伤的迹象,LDH浓度在基线(U / L)没有显著不同,但灌注4 h后,SNMP中位数更高。

两位盲法肾病理学家对肾组织切片进行了系统的组织病理学检查。在管状细胞坏死、水肿、管状管型或管状上皮细胞泡的评分方面没有发现显著差异，无法区分不同类型的缺血。

NO.2 通过脂质降解产物区分严重和轻度缺血性损伤

在猪组织的正离子模式分析中，磷脂酰胆碱(PC)和鞘磷脂大部分被观察为质子化、钠化和钾化形式的混合物，这是MSI中常见的现象。负离子模式可检测多种酸性脂质，包括磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磺胺类药物(ST)和心磷脂(主要是去质子化的([M-H])离子)。根据热缺血、冷缺血和对照肾脏获得的平均正离子和负离子光谱做ROC分析阐明缺血性损伤的区别性脂质MSI信号。总的来说，发现三个脂质的曲线下面积(AUC)值大于0.8(在热缺血时升高)。在m/z 1185.8和1207.8处观察到的离子在热缺血组织中升高(图2a)。m/z 1185.8离子为单溶血心磷脂[MLCL(54:6)H]，m/z 1207.8为钠加合物[MLCL(18:2 _ 18:2 _ 18:2)-2H+钠]。

NO.3 MSI作为判断生存力和缺血性损伤方法的潜力

在猪肾模型中，我们表明基于局部脂质分布图快速显示肾组织缺血性损伤是可行的。我们能够使用MSI可视化识别轻度和重度缺血性损伤肾脏的脂质变化。这种分析优势可能来自于对急性组织损伤期间发生的快速生化变化的检测。这种损伤可能不允许诱导显著的组织学变化，导致了急性缺血的组织学鉴定准确性差。在这种情况下使用MALDI-MSI有两个明显的优势。首先，通过快速评估缺血性损伤 肾脏使用MSI，这可能提供一个实用的工具来帮助生存能力评估，因此，它有潜力改善供体-肾脏的选择。随着MALDI-MSI仪器和自动化矩阵应用的快速发展，如本研究中所采用的，单个组织可以在30分钟内以50微米的空间分辨率在正离子和负离子模式下进行分析，这在临床移植中移植物存活性评估所需的关键时间范围内。其次，在这项研究中，我们发现了AKI中尚未描述的缺血性损伤的多种鉴别分子。特别是，与轻度缺血相比，一组溶血磷脂在严重缺血时显著升高。常规的基于MS的脂质组学通常不可能区分PLA1和PLA2驱动的水解。

NO.4 利用质谱鉴定脂质降解产物作为缺血标志物

使用MSI，我们能够在严重缺血的肾组织中识别缺血过程的替代标志物，如MLCL、LPC和LPI。对心磷脂活性的干扰已被证明在缺血再灌注对肾小管和内皮细胞的慢性肾脏损伤是有益的。我们现在是第一个在临床可接受的时间范围内快速测量和可视化缺血肾组织中升高的MLCL水平的人，测量心磷脂可评估移植物存活能力。

质谱成像（Mass Spectrometry Imaging, MSI）技术作为一种无需标记、高通量、高灵敏度和高精准度的分子可视化检测技术逐渐进入医学工作者、药物研发人员和科研工作者的视野。

空间代谢组学整合质谱成像和代谢组学技术，对动/植物组织中代谢物的种类、含量和差异性空间分布进行精准测定广泛应用于动/植物组织中代谢物、多肽和蛋白的时空分布研究，为传统代谢组学分析提供了全新的可视化视角和多维的信息深度。空间代谢组学能够在无标记条件下直接对生物组织切片进行扫描分析，可高效提取生物组织表面的化合物（脂质、氨基酸、代谢物、有机酸、糖类、多肽及蛋白等），同时鉴定数百种甚至数千种分子的分子结构、相对含量，并能精准定位不同化合物的空间分布，适用于肿瘤研究、生物标志物发现、药物研发、代谢异常疾病研究等，在精准医学、转化医学、临床研究以及基础生命科学研究领域具有非常重要的应用前景。