IF=15！质谱成像技术揭示铁死亡信号分子PEox的空间定位

● 期刊：Angewandte Chemie

● 发表时间：2021.04

● 影响因子：15.336

一、研究背景

脂质重编程已被认为是对许多生理和病理刺激的常见反应。目前基于液相色谱-质谱 (LC-MS)的脂质组学已经鉴定并在结构上表征了数千个单独脂质分子种类。然而，即使是最先进的LC-MS方案也无法提供有关脂质分子细胞内分布的信息。目前已开发了几种质谱成像技术用于探索脂质的分布。我们之前使用LC-MS的方案已经确定了过氧化磷脂酰乙醇胺(PEox)集合，它们在铁死亡中起主要作用。鉴于铁死亡与近100种不同的疾病和损伤有关，PEox及其代谢途径是治疗干预的重要目标，因此利用GCIB-SIMS质谱成像技术对PEox在细胞和组织中进行定位研究。

二、摘要

液相色谱质谱法(LC-MS)已将过氧化磷脂酰乙醇胺(PEox)物质确定为铁死亡的预测生物标志物；然而，尚未通过成像技术直接检测到PEox在特定细胞类型和组织中的存在和亚细胞分布。通过应用气体簇离子束二次离子质谱(GCIB-SIMS)成像，我们能够在铁死亡H9c2细胞和外伤性脑损伤后皮层或海马神经元中，在单细胞或亚细胞水平上以绘制PEox。

三、研究结果

NO.1 H9c2细胞中PEox的绘制分析

谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)抑制剂RSL3诱导70%的H9c2心肌细胞死亡，抗铁死亡剂 Ferrostatin-1(Fer-1)完全阻止了这种效应（图1A）。GCIB-SIMS成像揭示了过氧氢-PE (PE-OOH)的三种主要种类：PEp(36:4)-OH/OOH、PE(38:4)-OOH和PE(40:4)-OOH它们在对照和处理细胞中的非氧化前体离子（图 1B）。然而，LC-MS 显示，在RSL3处理的细胞中PEox信号的数量增加了2-3倍，并且它们的含量通过Fer-1处理恢复到控制水平（图 1C ，D）。

在GCIB-SIMS成像期间也观察到这种趋势，即在RSL3处理后增加PEox信号并在添加Fer-1后恢复到控制水平（图2）。我们目前的成像研究表明，H9c2细胞铁死亡中的PEox物质分布不均匀。我们之前的研究表明这些物质存在于局部区室（内质网、线粒体和线粒体相关膜）中并可能以最终破坏质膜的单个分子、簇或蛋白质加合物的形式存在。

PEox物质在2.5小时的RSL3处理时间点分布在整个细胞中（图1B) ，大约15%、30%和25%的 PEp(36:4)-OH/OOH、PE(38:4)-OOH和PE(40:4)-OOH物质分别与其非氧化前体PEp(36:4)、PE(38:4)和PE(40:4)共定位（图1E）。在RSL3处理的H9c2细胞中铁死亡诱导后，以306.08的质荷比检测到的GPX4辅助因子GSH显着降低，GCIB-SIMS信号强度确定的Fer-1处理部分保留了这些水平（表1）。

NO.2 小鼠组织中氧化脂质绘制分析

为了探索GCIB-SIMS对组织的适用性，我们接下来对大鼠大脑皮层中的氧化脂质信号进行了成像和评估。鉴于外伤性脑损伤(TBI)与铁死亡相关，我们在大脑中的两个不同区域进行评估：同侧损伤皮层和相应的对侧（非损伤）皮层（图 3）。GCIB-SIMS成像确定了两种氧化脂质：（PE(38:4)-OH,m/z=782.5,蓝色）和氧化形式的花生四烯酸(AA(20:4)-OH,m/z=319.23,绿色）（图 3B），PE(38:4)-OH和AA(20:4)-OH在同侧损伤区域显着增加（图4），并利用MS/MS分析得到证实。

正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)显示了关于主要脂质信号的两个特定神经元分组。同侧区域中的神经元在统计学上有显着差异，可与相应对侧区域中的神经元区分开来，同侧神经元显示出磷脂信号的比率降低（同侧比对侧）（图 5）。为了确定哪种脂质种类对区分同侧神经元和对侧神经元的贡献最大，我们应用了预测变量重要性 (VIP) 与其等级值图，这表明游离脂肪酸(FFA)在定义神经元分组之间的差异方面最具分辨性（图6）。

四、研究结果

GCIB-SIMS成像技术，使我们第一次能够同时观察到低丰度的PEox和FFAox物质，以及代谢物(如GSH)的显著变化，这些变化是RSL3诱导的心肌细胞铁死亡和TBI神经元细胞死亡的结果。GCIB-SIMS成像技术的这一进展将增加其在不同磷脂在不同细胞内区室和细胞间通讯中的信号作用等研究中的应用。

五、科研延伸

铁死亡（Ferroptosis）是一种铁依赖性的，区别于细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬的新型的细胞程序性死亡方式。铁死亡的主要机制是，在二价铁或酯氧合酶的作用下，催化细胞膜上高表达的不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化，从而诱导细胞死亡；此外，还表现为抗氧化体系（谷胱甘肽系统）的调控核心酶GPX4的降低。氧化脂质是指多不饱和脂肪酸发生自动氧化或者特定酶作用下生成一系列的过氧化代谢产物。氧化脂质的变化能够很好的说明铁死亡机制的发生。但氧化脂质在生物体内其含量低、易氧化及同分异构体多，所以检测困难。迈维代谢针对氧化脂质检测，优化实验方法，形成了可以对120种多不饱和脂肪酸及过氧化代谢产物的绝对定量检测。

Q:为什么要做脂质组学研究？

A:“脂质组学”实际上是“代谢组学”的一个分支。但是，由于脂类代谢 (如血浆中约70%的代谢物是脂类) 是动植物代谢物中的第一大类，是动植物代谢研究中最为关注的热点，参与能量运输、细胞间的信息通讯与网络调控等生长发育过程中的必需事件。作为细胞膜和脂滴的主要组成成分，各种结构的脂类在广泛的生物学过程，如信号传导、运输作用以及具有不同生化性质的生物大分子分选过程中，扮演着重要角色。

Q:为什么要做质谱成像研究？

A:空间代谢组学（Spatial Metabolomics）将代谢组学信息扩展到了二维乃至三维的水平，研究小分子在组织切片中的空间分布，告诉我们变化“在哪里发生”，从而极大拓展了对代谢组学样品信息的认知，实现高空间分辨精准定位组织中代谢物的分布对阐明代谢物的合成、积累和调控机理至关重要。