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diaPASEF:复杂蛋白质组样本的非标定量

发布时间: 2019-11-06 15:20 来源: 布鲁克(北京)科技有限公司-质谱仪器

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基于DIA(Data-Independent Acquisition,数据非依赖采集)的方法将整个全扫描范围分为若干个窗口,并循环地对每个窗口中的所有离子进行碎裂和检测,这种方法的缺失值少并且定量准确、变异小,有望在大样本队列中实现可重复和准确的蛋白质组定量。由于timsTOF Pro检测CCS值的高重复性,使得基于4D(保留时间(retention time)、离子淌度(mobility)、质荷比(m/z)、离子强度(intensity))谱图库的匹配更具有吸引力。布鲁克与苏黎世联邦理工学院、德国马普研究所和多伦多大学合作,将PASEF与DIA的优势相结合,产生了一种新的采集模式称为diaPASEF(图1)。

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在diaPASEF扫描模式中,母离子在进入四级杆之前已经通过淌度进行了累积和分离,根据碰撞截面积(CCS)大小依次洗脱(与m/z有一定相关性),这样四级杆就可以根据洗脱离子的m/z进行离子选择,并且每批PASEF都会有多个窗口进行扫描,从而提高离子的利用率,避免了传统DIA方法中离子利用率低的问题。此外,使用离子淌度和质量数双重隔离窗口来触发MS/MS,提高了母离子选择和匹配的准确性,并降低了二级混合谱图的复杂性并且在一级热图中,可以选择多电荷区域作为dia-PASEF的母离子窗口,有效屏蔽单电荷杂质的干扰。采用diaPASEF测定200ng HeLa酶解液时,单个2h梯度鉴定了7000多种蛋白质;10ng HeLa酶解液,鉴定到3000多种蛋白质。


为了进一步评价diaPASEF的非标定量能力,我们将HeLa、酵母、大肠杆菌的肽段分别按照65%、30%、5%(HYE-A样本)和65%、15%、20%(HYE-B样本)混合,单针上样量为200ng,采用diaPASEF模式32个窗口的方法进行数据采集,然后通过Spectronaut软件进行数据处理。谱图库采用ddaPASEF的模式采集,共含有13,013个蛋白、136,682个特异性肽段。在假阳性率低于1%的条件下,单针diaPASEF超过8000个蛋白质可以获得可靠的定性及定量结果(图2上),定量值跨越5个数量级,两个样本的蛋白定量CV中位数分别为6.7%和7.2%,肽段定量CV中位数分别为8.1%和8.6%(图2下),并且三次技术重复的相关性平均值为0.99,具有优越的定量稳定性。

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在HYE-A和HYE-B样本中,分别对HeLa、酵母、大肠杆菌的蛋白进行定量对比,这三个物种蛋白的ratio分布于1.0、1.9、0.3,接近于理论值1.0、2.0、0.25,并且被清晰地分割开,定量结果可靠、稳定(图3)。

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目前,Mobi-DIK、PEAKS、Spectronaut、MaxQuant和Skyline等蛋白质组学软件均支持diaPASEF的数据分析,可实现质量数、保留时间、离子淌度和信号强度的4D特征校准和准确定量。不依赖于图谱库的diaPASEF数据采集方法,以及全新三维靶向PRM(3D-targeted PRM)方法正在开发中。


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