CE-TIMS重磅联用——精准解析单神经元细胞肽段立体化学结构

离子淌度可为色谱中无法分离的共洗脱肽段提供多一维度的分离可能性，离子淌度分离概念的引入使得蛋白质组学进入了4D新时代。4D-Proteomics™是在3D分离即保留时间（retention time）、质荷比（m/z）、离子强度（intensity）这三个维度的基础之上增加了第四个维度，离子淌度（mobility）的分离（图1），进而大幅度的提高扫描速度和检测灵敏度，带来蛋白质组学在鉴定深度、检测周期、定量准确性等性能的全面提升。

单神经元细胞肽段立体化学结构研究意义及挑战

在一些重要的生物学问题中，需要进行单细胞蛋白质组学分析，从而在形态学上相似的细胞群间探索分子异质性以找到解答。这种建立在细胞层面的差异分析，也为理解人体正常生理活动，解决肿瘤免疫、干细胞疗法研究等提供丰富分子层面信息。以神经元细胞为例，了解其细胞信号传递尤为重要，而参与细胞间信号传递的内源肽因其多样性，使其成为细胞群间异质性的常见来源，特定内源肽可以对选定的残基进行翻译后异构化，产生重要的物理化学性质改变及生理意义，其中，酶促L-转D-氨基酸残基异构化是分泌途径中较不常见的翻译后修饰，但为肽段结构和生理功能提供了大量多样性。而肽段的异构化在翻译后修饰中是亟待解决的分析难题，主要源于过去关于肽段立体结构研究的相关单细胞分析技术发展十分有限，传统的分子生物学方法及生化方法无法在单细胞层面分析含D-氨基酸的肽段（D-amino acid containing peptides, DAACPs），使得在单细胞水平研究肽段异构化具有很大的挑战性。近日，伊利诺伊大学香槟分校化学系Jonathan V. Sweedler研究团队在Analytical Chemistry期刊上发表名为“Analysis of Peptide Stereochemistry in Single Cells by Capillary Electrophoresis − Trapped Ion Mobility Spectrometry Mass Spectrometry”文章，使用CE-TIMS联用技术，为单神经元细胞肽段立体化学结构分析提供了强而有力的分析手段。

timsTOF Pro: 单神经元细胞肽段立体化学结构分析利器

作者考虑到如液相色谱法等基于液相分离方法存在样本稀释及清除步骤，即使结合常规质谱分析仍在单细胞肽段立体结构分析上存在极大挑战。因此在进入质谱前的肽段分离，作者选用毛细管电泳作为分离手段，因为毛细管电泳（CE）更便于小体积样本（pL-nL 样本体积，将样本稀释最小化，改善少量样本的离子化）分析，当与MS分析结合使用时，非常适合进行个体细胞的生物分子表征。然而，CE分离立体异构肽段可能需要与MS不兼容的缓冲液体系和手性选择性试剂，因此CE-MS在DAACPs的表征仍具有很大的挑战性。

而毛细管电泳结合捕集离子淌度质谱（CE-TIMS）可以规避掉利用CE-MS在单细胞中DAACPs分析所面临的一些挑战。原因以下几点：

相较于单独的ESI（电喷雾电离）-MS，ESI-TIMS MS分析可实现更低的检测极限并增加MS谱图特征检测；

TIMS在气相中根据分子几何形状对异构体/等重离子进行分配，为离子提供额外一维的分离，可分辨具有细微结构变化的非对映异构肽段，而这些结构变化恰恰不容易通过液相进行分；

TIMS平行累积连续碎裂技术可实现数十至数百毫秒的采集周期速度和淌度解析，这与其中分析物可以在较窄的迁移时间范围内迁移的高效CE 分离兼容；

TIMS可使离子在电场中进行时间及空间的聚焦，提高信噪比和达到更低的检测极限，同时离子利用率达100%，将离子损耗降至最低。

综上所述，TIMS在小体积生物样品的分析应用方面具有极大优势，CE联用TIMS MS具有在单细胞水平上表征DAACPs的极大潜力。作者建立的CE−TIMS MS工作流程，能够准确分析单个神经元细胞中内源性神经肽的立体化学结构（图2）。

基于CE-TIMS的高灵敏度、高立体选择性肽段立体结构研究

文章中对从海兔分离出来的单个神经元中，来自胸膜素前驱物（NP_001191654.1）的三种已知经过翻译后L-转D-氨基酸残基异构化神经肽Plrn1、Plrn2和Plrn3，进行检测及立体结构的表征。通过CE−TIMS MS分析单神经元细胞提取物，并将原生Plrn1−Plrn3与13C标记的Plrn1−Plrn3合成标肽的离子淌度进行比较，从而评估原生肽的立体化学。

作者利用CE-TIMS对合成的13C Plrn1−Plrn3标肽进行表征，以确定其对非对映异构体分离的可行性。图3为合成的13C Plrn1−Plrn3标准肽的提取离子淌度图（EIM），TIMS将在CE中无法进行有效分离的13C L-/D2-/D3-Plrn1−Plrn3提供多一维度的分离，实验对于13C-Plrn1和13C-Plrn2非对映异构体，实现了106至162的淌度分辨率，而对于13C-Plrn3非对映异构体，实现了37至142的淌度分辨率。EIM中存在多个峰表明，这些肽段可以在TIMS中存在多个稳定的气相构象，为后续的原生Plrn1−Plrn3的EIM提供参考。

为了确定Plrn1−Plrn3在单个神经元中的立体结构化学性质，作者直接比较了合成Plrn1−Plrn3和原生Plrn1−Plrn3的离子淌度分布，图4显示原生肽与合成13C-L-Plrn1−Plrn3淌度峰非常相似，且皆有多个异构体峰。然而，在原生Plrn1− Plrn3的离子淌度分布中并没有出现如图3显示的D2-/D3- Plrn1−Plrn3对应的离子淌度，也没有出现图4的混合合成肽的非对映异构体的离子淌度，考虑到胸膜神经节的胸膜神经元与邻近神经节的细胞过程（将含有神经肽的分泌囊泡递送到其释放位点）是透过神经节结缔（图5），因此单胸膜神经元中不存在异构化的Plrn1−Plrn3可能是因为异构化肽段存在于神经元过程（轴突）而非细胞本体中。

图4. TIMS解析原生Plrn1− Plrn3的离子淌度分布图

图5. 胸膜神经元过程以红色描绘，延伸至脑-胸膜结缔

随后作者对神经节结缔进行CE-TIMS MS分析，利用TIMS离子淌度分离能力，成功解析出脑-胸膜结缔中原生D2- Plrn2（图6，该1/k0为1.06）及L-Plrn2，并透过13C-L-Plrn2和13C-D2-Plrn2估算出其中原生肽D2-Plrn2与L-Plrn2的比率约为0.8:1，该结果支持之前假设，即胸膜素前驱肽的异构化集中在轴突而不是细胞体中，这也与先前以小龙虾为分析物种发表的研究结果一致。

图6. CE-TIMS MS 获得的提取离子淌度图显示D2-Plrn2存在脑-胸膜结缔

综上所述，将样本稀释最小化的CE结合高灵敏度、扫描速度及选择性的TIMS可为单细胞层面原生肽和非对映异构肽的研究提供可靠结果。作者也将继续利用CE-TIMS MS研究外部化学刺激对单胸膜神经元中DAACPs水平的影响，此技术也同样适用于分析海兔中其他已知的DAACPs或检测仅存在于罕见的细胞类型中低丰度的DAACPs。相信CE-TIMS MS分析方案在未来可以扩展到各物种单细胞的DAACPs研究，以进一步阐明L-转D-氨基酸残基异构化的分子机制。

参考文献：

1.   Jonathan V. Sweedler, et al., Analysis of Peptide Stereochemistry in Single Cells by Capillary Electrophoresis−Trapped Ion Mobility Spectrometry Mass Spectrometry, Analytical Chemistry, 2021, 93, 6205–6213

2.   Alireza Mashaghi, et al., Deciphering Metabolic Heterogeneity by Single-Cell Analysis, Analytical Chemistry,2019, 91, 13314-13323

3.   Lingjun Li, et al., Molecular basis for chirality-regulated Aβ self-assembly and receptor recognition revealed by ion mobility-mass spectrometry, Nature Communications, 2019, 10, 5038