两项新技术解决外囊泡磷酸化蛋白组学深度分析难题

离子淌度分离概念的引入使得蛋白质组学进入了4D新时代。4D-Proteomics™是在3D分离即保留时间（retention time）、质荷比（m/z）、离子强度（intensity）这三个维度的基础之上增加了第四个维度，离子淌度（mobility）的分离（图1），进而大幅度的提高扫描速度和检测灵敏度，带来蛋白质组学在鉴定深度、检测周期、定量准确性等性能的全面提升。

细胞外囊泡磷酸化分析意义与难点

蛋白质磷酸化修饰参与各种生理和病理过程，在信号转导通路、细胞凋亡、发育分化、癌症发生发展方面有着重大研究意义。血液、尿液等作为最常见易得的临床样本，通常是疾病机理研究和标志物研究最理想的研究对象。然而由于体液中碱性磷酸酶和高峰度干扰蛋白的存在，无法较好地直接对体液样本进行磷酸化修饰组学研究，但体液中的胞外囊泡激酶和磷酸化蛋白含量丰富，且携带起源细胞或组织的信息，对于疾病探究具有极大的意义。细胞外囊泡（EVs）是细胞间通讯的重要载体，携带了蛋白质、脂类、核酸等多种物质，其与多种疾病的发生发展相关，也是当前疾病诊断标志物的研究热点。近年来, 基于质谱技术的蛋白质组学研究取得了令人瞩目的成果,而其也被证明是目前针对蛋白翻译后修饰研究最行之有效的方法。然而目前针对体液样本胞外囊泡蛋白分析存在诸多困难：（1）生物体液中分离胞外囊泡效率低；（2）从样本制备到后续液质分析流程繁琐，导致重复性很难保证；（3）胞外囊泡蛋白含量低，而如何从如此低含量蛋白中有效鉴定更低含量的磷酸化蛋白并进行分析，这对于分离手段和质谱灵敏度都提出了很高的要求。
高灵敏度高深度外囊泡磷酸化修饰分析
普渡大学的陶纬国教授团队在《ACS Appl Mater Interfaces》杂志上发表了题为“Synergistically Bifunctional Paramagnetic Separation Enables Efficient Isolation of Urine Extracellular Vesicles and Downstream Phosphoproteomic Analysis”文章，为尿液样本的胞外囊泡磷酸化蛋白组学分析提供了新方法。

1 胞外囊泡磷酸化蛋白分析流程
文章介绍了一种新型的双功能磁珠（BiMBs）可以实现对尿液中胞外囊泡蛋白进行高效特异性富集，结合布鲁克推出的高灵敏度高扫描速度timsTOF Pro用于尿液样本的磷酸化蛋白组学分析。具体流程见图1，双功能磁珠直接加入尿液样本中即可快速实现（小于1h）对胞外囊泡蛋白特异性富集，分离出富集后的磁珠进行蛋白变性、酶切等处理，然后使用PolyMAC Phosphopeptides Enrichment Kit 对磷酸化多肽进行富集，后续样本就可进行LC/MS分析。

2 双功能磁珠(BiMBs)材料富集特异性和回收率考察  
通过对比不同胞外囊泡蛋白富集手段，使用双功能磁珠（BiMBs）材料富集单针可鉴定36262个独特肽段对应3302个蛋白（见图2A），远超其它富集材料和超速离心分离（UC）。通过对比鉴定蛋白与发表在ExoCarta上的前100外泌体标志蛋白，双功能磁珠（BiMBs）材料富集样本可以涵盖到95个外泌体标志蛋白（见图2B）。进一步选出13个外泌体标志蛋白和尿液标志蛋白来考察材料富集特异性和回收率，用双功能磁珠（BiMBs）材料富集样本外泌体标记蛋白非标定量结果远高于其他材料和富集手段，而尿液游离蛋白（非特异富集蛋白以作为污染蛋白）定量结果则很低，展现材料对于胞外囊泡蛋白高富集特异性和回收率。

3 分析流程应用于前列腺癌研究
前列腺癌在男性癌症死亡原因中占比很高，因此开发一种无创的方法来检测前列腺癌症患者所处状态有着重大意义。将合成的双功能磁珠（BiMBs）材料应用于前列腺癌患者和健康人临床尿液样本分析，在癌症组和健康组中分别鉴定到6823和6726条胞外囊泡磷酸化肽段，对应1564和1413个尿液胞外囊泡磷酸化蛋白。通过火山图分析（见图3A），定量出121个上调磷酸化蛋白和103个下调磷酸化蛋白，蛋白分类表明这些磷酸化蛋白涉及信号转导，细胞外区域以及分子与蛋白激酶活性相关的功能。KEGG通路分析表明，这些磷酸化蛋白参与了一些生物过程，比如蛋白多糖P13K−Akt/AMPK信号通路，以及前列腺癌相关通路（见图3B）。

4 离子淌度技术应用于同分异构肽段的分离
timsTOF Pro平台因其超高淌度分辨率，为修饰位点异构肽段的分离提供了更多可能。本研究中，利用离子淌度分离能力，将蛋白CBX3上的SLSDSESDDSK肽段两个不同的磷酸化位点分离开（见图4），蛋白CBX3仅在癌症组中发现，CBX3也被认为与前列腺癌有关。保留时间14.8min/质荷比625.22的EIM（Extracted Ion Mobilogram）图，可以发现两条共洗脱的同分异构肽段在淌度分析器里得到了良好的分离，通过EIM图中峰面积可实现两种不同修饰位点状态的准确定量。淌度的有效分离也使得两条肽段分别得到了更可靠的二级谱图，通过MS/MS谱图可以对磷酸化位点实现准确定位。额外一维淌度分离不仅极大提高了峰容量，淌度信息也使得鉴定结果更可靠，这将使得4D-蛋白组学平台timsTOF Pro将在蛋白翻译后修饰研究中大有可为。

综上所述，高选择性高回收率的双功能富集材料结合timsTOF Pro带来的超高灵敏度，为深度胞外囊泡磷酸化修饰分析树立了新标准。相信基于4D质谱平台开发的尿液胞外囊泡蛋白质组学新方法，将在寻找疾病标志物，以及代谢和免疫相关疾病的诊断或治疗方面具有很大的应用价值。  
参考文献：  
I-Hsuan Chen, et al., Phosphoproteinsin extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017,114(12):3175-3180  
Jie Sun, et al., Synergistically Bifunctional Paramagnetic Separation Enables Efficient Isolation of Urine Extracellular Vesicles and Downstream Phosphoproteomic Analysis.ACS Appl Mater Interfaces. 2021, 13(3):3622-3630  
Florian Meier, et al., Online Parallel Accumulation-Serial Fragmentation (PASEF) with a Novel Trapped Ion Mobility Mass Spectrometer, Mol Cell Proteomics. 2018,1(12):2534-2545