基于timsTOF Pro的胰岛β-细胞的蛋白组学研究

据统计，2019年全球约有420万人死于糖尿病及相关并发症，对人类社会产生巨大的临床医疗负担及经济负担。糖尿病是一种复杂的慢性代谢性疾病，近期研究显示炎症也是糖尿病的致病因子之一，但炎症是如何在生理机制上调节β-细胞葡萄糖代谢及胰岛素分泌依然未知。这主要是因为胰岛细胞的异质性（胰岛细胞由包括β-细胞等不同类型几种胰岛细胞组成）以及β-细胞在人类胰岛细胞中的数量低给其研究带来了困难和挑战。因此，对β-细胞进行蛋白组学研究对于质谱仪器的灵敏度提出了很高的要求。

布鲁克timsTOF Pro质谱系统展现的超高灵敏度（离子在淌度管内实现时间和空间上的聚焦）及高扫描速度（扫描速度>120 Hz）的特点，对于此类型样本分析有着其得天独厚的优势。实验利用timsTOF Pro首次对富集后的β-细胞进行系统性的蛋白组学分析，最后鉴定到超过5000个蛋白，得到超过3000多个蛋白的相对定量信息，其中包括胰岛β-细胞中多个关键的代谢酶表达信息，为研究糖尿病中炎症反应与葡萄糖代谢相互作用机制提供重要信息。

实验设计

样本前处理流程见图1.A，简述如下：捐赠者胰岛使用Accutase细胞消化液分散细胞后感染表达绿色荧光蛋白ZsGreen的腺病毒，感染96小时后收集细胞，利用AriaII Cell Sorter 进行细胞分选，富集得到的β-细胞（特异性>95%）依次进行裂解，蛋白还原烷基化，胰蛋白酶水解及肽段除盐。

图1.A：β-细胞蛋白组学分析工作流程：样本前处理流程

最后处理得到的样本使用液质联用进行分析（如图1.B），使用DEEP SEQ fully automated 3D fractionation platform（第一维：高PH反相；第二维：高PH强阴离子交换；第三维：低PH反相）搭配布鲁克timsTOF Pro离子淌度质谱仪进行分析。实验中采用的质谱参数见图2。采集数据使用PEAKS Studio 10.0，Pep2gene及multiplierz scripts进行分析。

图1.B：β-细胞蛋白组学分析工作流程：仪器分析流程

图2：布鲁克timsTOF Pro应用优势及实验相关参数设置

实验结果

过去研究表明，不同葡萄糖激酶激活物(调节葡萄糖代谢的初始阶段)导致的细胞存活情况与炎症相关因子有关，而炎症细胞因子如何与葡萄糖代谢相互作用以支持或抑制细胞存活尚不清楚，部分原因是由于人类胰岛细胞的异质性使得衡量β细胞单独的贡献部分变得尤为困难，因此分选出β细胞并对其蛋白表达进行研究就显得尤为重要。实验通过细胞分选从三个捐献者的胰岛中各收集了将近30000个β-细胞，并整合DEEP SEQ fully automated 3D fractionation platform及布鲁克timsTOF Pro，进行分析以最大化蛋白的覆盖深度。

图3：timsTOF Pro质谱平台上β-细胞蛋白组学分析结果。（A）β-细胞中鉴定蛋白丰度分布图；（B）鸟氨酸转氨酶（OAT）母离子出现时的MS全扫谱图；（C）TIMS累积后鸟氨酸转氨酶（OAT）母离子及其对应MS/MS图

通过timsTOF Pro分析（如图3），最后鉴定到超过5000个蛋白，得到超过3000多个蛋白的相对定量信息，其中包含多个调控尿素循环代谢的酶，这些蛋白与基因的表达具有高度的一致性。图3右半部分质谱信息显示鸟氨酸转氨酶（OAT）母离子经过TIMS累积后信噪比增加，而且额外一维淌度分离极大提高峰容量，使其能够产生高质量二级谱图，展现timsTOF Pro超高灵敏度以及复杂体系蛋白鉴定能力。进一步数据分析显示，在面对炎性细胞因子时，丙酮酸羧化酶（PC）整合葡萄糖激酶（GK）信号，促进精氨酸代谢生成尿素，从而抑制一氧化氮的产生，表明葡萄糖与精氨酸代谢之间的关联有望成为糖尿病新的治疗标靶。

实验小结

timsTOF Pro结合其高灵敏度、高扫描速度的应用优势，能够实现β-细胞蛋白组的深度覆盖，为在分子水平研究β-细胞生理学和发现糖尿病潜在的靶向通路提供了新方案，展现了timsTOF Pro质谱平台在疾病机理和基础临床研究中广阔的应用前景。

参考文献

• Scott B. Ficarro, et al., Proteomic Interrogation of Primary Insulin-secreting Pancreatic β-cells. 1880267-LCMS-174

• Fu A, et al., Glucose-dependent partitioning to urea cyclespares β-cells from inflammation. Nat Metab. 2020, 2, 432-446

• Scott B Ficarro, et al., Improved electrospray ionization efficiency compensates for diminished chromatographic resolution and enables proteomics analysis of tyrosine signaling in embryonic stem cells. Anal Chem. 2009, 81, 3440-7