基于质谱成像的微区域蛋白组学

发布时间： 2020-09-24 10:53 来源：布鲁克（北京）科技有限公司-质谱仪器

质谱成像技术（MSI）可以直接研究化合物分子在生物组织的空间分布。由于质谱成像对分子鉴定的分析深度有限，因此需要将质谱成像与更灵敏的基于局部萃取的多组学方法相结合，以得到分子的全面表征。根据质谱成像提供的分子空间信息对于后续的组学研究非常重要，它可用于辅助组织样本特征区域的激光显微切割，以及随后进行的高灵敏LC-MS/MS分析。包含基质辅助激光解吸电离源（MALDI）和电喷雾电离源（ESI）双离子源质谱仪的最新发展，可以在同一台质谱仪器上实现最先进的质谱成像和LC-MS/MS蛋白质组学功能。

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本研究使用了布鲁克timsTOF fleX双离子源成像组学质谱系统，该系统配备了快速质谱成像的10kHz MALDI激光器和一个正交电喷雾源，并结合了捕集型离子淌度分离（TIMS）和平行累加序列碎裂（PASEF）技术获得100Hz MS/MS高速度和高灵敏度。本研究的目的是将MALDI成像提供的空间分子信息与特征区域LC-MS/MS分子表征相结合，在单一仪器上完成空间多组学实验。工作流程如图1所示。

图1. 单一质谱仪器上的空间组学工作流程。对组织切片进行MALDI质谱成像，成像数据经聚类分析产生不同的分区，并和染色样本的光学图像匹配，把目标区域位置信息地传输到激光显微切割（LMD）系统中进行显微切割，随后在同一仪器上使用HPLC-ESI-MS/MS对LMD样品蛋白质进行鉴定。

本研究的样本是Liege大学组织生物库的乳腺癌组织，样本冷冻切片后安装于聚乙烯萘甲酸酯（PEN）玻片上，干燥后施加去甲哈尔满基质进行质谱成像。质谱条件：正模式，空间分辨率50µm，质量范围m/z300–1600，采样速度25像素/s。在质谱成像实验后，用70%乙醇洗去基质并用苏木精染色，用高分辨率扫描仪扫描组织切片，由病理学家划定肿瘤区域。质谱成像数据通过布鲁克SCiLS Lab 2020a软件处理产生组织学分区并得到三个亚群，它们在组织学检验上不能被区别。

从每个区域中随机选择三个亚区（≈2000个细胞）进行LDM显微切割，得到9个样本。经过胰酶切处理后进行LC-MS/MS分析。色谱条件：布鲁克nanoElute HPLC，IonOpticks Aurora 25cm×75µm×1.7µm C18色谱柱；流动相A: 2%乙腈水溶液（0.1%甲酸），流动相B: 乙腈（0.1%甲酸）；流速：400 nL/min的流速，洗脱时间: 100min；柱温：50°C。质谱条件：布鲁克CaptiveSpray纳喷源，毛细管：180°C和1.6 kV，干燥气：3.0L/min。质量范围：m/z100–1700，MS/MS PASEF模式；TIMS淌度: 0.6–1.61/k0，TIMS Cell累加和斜率：100ms.

蛋白鉴定和无标记定量（LFQ）使用MaxQuant软件和Swiss-Pro人类蛋白数据库检索。每个样本得到平均2000个蛋白鉴定（FDR<0.01），显示了LC-MS/MS对微量样品的高灵敏度。然后使用“运行间匹配”（MBR）方法对每个区域的三个样本进行LFQ差异分析，每个区域得到平均2500个蛋白鉴定，以及对所有区域分组的3040个蛋白鉴定。三个区域的蛋白鉴定有很高的重叠，平均21.8%为区域特异性蛋白，表明三个肿瘤亚群之间的高度相似性。

本研究还进行了乳腺癌组织的脂质成像，用布鲁克MetaboScape 5.0和LipidMaps对成像数据进行分子注释，m/z786.60、734.57、760.58、788.62和703.58分别对应于磷脂酰胆碱PC（36:2）、PC（32:0）、PC（34:1）、PC（36:1）和鞘磷脂SM（34:1）。这些脂类可作为乳腺癌的生物标志物或肿瘤分级和预后。本研究发现了164种蛋白质的显著变化，其中一些与脂质代谢有关。

本研究使用质谱成像作为筛选工具，首先寻找组织中明显的分子空间差异，在此基础上用同一仪器进行进一步组学分析研究。MALDI和ESI组合质谱仪timsTOF fleX在成像和组学方面都表现出了最高性能，将分子的空间维度与蛋白质组学数据完整连接起来。

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