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当4D-蛋白质组学技术遇上XL-MS,燃爆!

发布时间: 2020-08-28 15:34 来源:布鲁克(北京)科技有限公司-质谱仪器

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基于 timsTOF Pro 的 4D-蛋白质组学技术带来的扫描速度、灵敏度和分析通量的提升已经得到广泛的证明,而离子淌度这一额外维度的分离,更是显现出来巨大的扩展潜力,这也引起了结构生物学家的注意。乌得勒支大学的 Albert Heck 实验室在蛋白质组学、用质谱研究蛋白质结构和相互作用方面,具有20多年的丰富经验,在国际上一直遥遥领先。最近布鲁克与乌得勒支大学 Albert Heck 团队宣布进行合作,在 timsTOF Pro 上开发交联质谱技术分析方法,将 4D-蛋白质组学技术拓展到结构生物学领域。
交联质谱技术是近年来发展起来的新技术,在研究蛋白质结构与相互作用方面具有速度快、通量高、成本低、样本量少、蛋白质各方面性状要求低、适合分析体内非变性蛋白复合体结构等独特的优势,可以与冷冻电镜(cryo-EM)技术进行互补。

交联质谱技术采用化学交联剂处理蛋白质样品,将空间距离足够接近、可以与交联剂反应的两个氨基酸以共价键连接起来,酶切后利用质谱技术分析交联产物。交联蛋白质在不同位置发生酶切,可以产生三种交联产物:1)肽段间交联;2)单链肽段内部交联;3)被交联剂单侧修饰的单链肽(图1)。这些交联的肽段丰度偏低、信号差,容易受到高丰度的非交联肽段的掩盖,给交联谱图鉴定带来困难。为了提高交联肽段的鉴定量,常采用可富集的交联试剂,通过亲和纯化富集交联肽段,然后采用液质联用进行鉴定,排除非交联肽段的干扰。然而即使采用非常有效的可富集的交联试剂,如PhoX,交联肽和被交联剂单侧修饰的单链肽会被共同富集,丰度较高的单链肽阻碍了交联肽的有效鉴定。

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图1. 化学交联产物的类型(肽段间交联、肽段内交联、单侧修饰的单肽段)

布鲁克推出的 4D-ProteomicsTM 采用捕集离子淌度(Trapped Ion Mobility Spectrometry, TIMS)根据离子的形状和大小进行分离,并准确测量碰撞截面积(Collisional Cross Section, CCS),在同步累积连续碎裂(Parallel Accumulation Serial Fragmentation, PASEF)扫描模式下二级谱图的采集速度约 100Hz,具有鉴定深度、定量准确性、检测速度、仪器稳定性等性能的全面提升。布鲁克与荷兰蛋白质组学中心、乌得勒支大学联合开发,推出了基于timsTOF Pro/fleX 的交联质谱方案及独特的 caps-PASEF(Collisional Cross Section Assisted Precursor Selection)扫描模式(图2),初步结果显示布鲁克捕集离子淌度质谱 timsTOF Pro/fleX 与化学交联技术相结合,采用 4D-ProteomicsTM 分离、鉴定交联肽段,在淌度、m/z 窗口对离子进行选择性扫描,显著提高交联肽段的鉴定量,并且捕集离子淌度可以有效地区分交联肽段和单侧连接肽段,并获得肽段的 CCS 值。这个结果已经在2020年7月发表于Molecular & Cellular Proteomics
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图2. TIMS分离交联肽段。A. 采用双TIMS结构进行交联肽段和单侧连接肽段的富集和淌度分离;B. 交联肽段的二级谱图鉴定;C. 母离子的淌度1/k0和m/z分布图;D. 淌度区分交联肽段和单侧连接肽段;E. 母离子的淌度碰撞截面积CCS和m/z分布图。(C. D. E. 红色为交联肽段;蓝色为单侧修饰肽段;灰色为其他母离子)

交联肽段的分布集中于 500Å2、2000Da 以上的区域,针对这些特征,推出了 caps-PASEF 扫描模式,重新设定了母离子 CCS、m/z 扫描区域。这种新型的 caps-PASEF 扫描模式,不仅可以屏蔽单电荷杂离子的干扰,还能减少 50 - 70% 针对单侧连接肽段的扫描,使质谱分析更集中于交联肽段(图3)。

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图3. caps-PASEF扫描模式用于交联肽段的分离和鉴定。A. 母离子的淌度碰撞截面积CCS和m/z分布图;B. 母离子的淌度碰撞截面积CCS和m分布图,红色虚框里是母子扫描区域;C. 选择框内、外,交联肽段、单侧连接肽段的母离子数目统计;D. 选择框内的母离子CCS和m分布图;E. caps-PASEF和经典PASEF扫描模式下,交联肽段、单侧连接肽段的母离子数目统计。(红色为交联肽段;蓝色为单侧修饰肽段;灰色为其他母离子)

对于简单蛋白质、蛋白质混合物以及高度复杂裂解产物的检测时,这种 caps-PASEF 扫描模式可显著增加交联肽段的鉴定量。目前,相关的 4D-ProteomicsTM 交联质谱的数据分析、统计学方法仍在开发中。随着布鲁克和合作团队对样本处理、采集模式、分析算法的不断开发,4D-ProteomicsTM 交联质谱必将越来越完善,在蛋白质结构与相互作用领域展现出更加广泛的应用前景。

 

 参考文献

  1. Benefits of Collisional Cross Section Assisted Precursor Selection (caps-PASEF) for Cross-linking Mass Spectrometry. Steigenberger B, Van den Toorn H, Bijl E, Greisch JF, Räther O, Lubeck M, Pieters RJ, Heck AJR, Scheltema RA., Mol Cell Proteomics, 2020 Jul 21:mcp.RA120.002094. doi: 10.1074/mcp.RA120.002094. Online ahead of print.

  2. PhoX: An IMAC-Enrichable Cross-Linking Reagent. Steigenberger B, Pieters RJ, Heck AJR, Scheltema RA. ACS Cent Sci. 2019 Sep 25;5(9):1514-1522.

  3. Efficient and robust proteome-wide approaches for cross-linking mass spectrometry. Klykov, O., Steigenberger, B.,Pektaş, S. et al. Nat Protoc 2018 Dec 13, 2964–2990. https://doi.org/10.1038/s41596-018-0074-x

  4. Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry. Liu F, Rijkers DT, PostH, Heck AJ. Nat Methods. 2015 Dec 12(12):1179-84. doi: 10.1038/nmeth.3603

  5. Probing Native Protein Structures by Chemical Cross-linking, Mass Spectrometry, and Bioinformatics. Leitner A, Walzthoeni T, Kahraman A, Herzog F, Rinner O, Beck M, Aebersold R. Mol Cell Proteomics. 2010 Aug;9(8):1634-49. doi: 10.1074/mcp.R000001-MCP201.


标签:布鲁克,4D,蛋白质组学,XL-MS
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