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人物专访 | Ben Collins博士 | dia-PASEF在定量蛋白质组学研究的优势和前景

发布时间: 2020-07-30 13:34 来源:布鲁克(北京)科技有限公司-质谱仪器

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  贝尔法斯特女王大学生物科学学院的Ben Collins博士近日接受了《News Medical》的专访,介绍了其所在的实验室在timsTOF Pro质谱平台上开发的4D-DIA方法 —— dia-PASEF的背景,以及采用dia-PASEF进行定量蛋白质组学研究的优势和应用前景。

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  dia-PASEF®简介

  传统的DIA策略能保证在一个预设m/z窗口里的每一个母离子都能被获得碎片信息,但谱图的高度复杂让数据分析极具挑战,更窄的隔离窗口能降低谱图的复杂度,但需要增加循环时间来覆盖完整的m/z范围,并且如果采用32或者64个窗口时,由于每个母离子在第个循环里只能被采集一次,离子的利用率非常低。布鲁克timsTOF Pro的PASEF的高扫描速度和高灵敏度已经被广泛证明,在timsTOF Pro上开发dia-PASEF技术显示出其高扫描速度和高灵敏度的优势的同时,离子淌度提供的额外一个维度的分离,使DIA数据采集时在不牺牲窗口循环速度的同时,降低谱图复杂度和提高离子利用率。

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图:dia-PASEF

  Q:为什么科学家想对人类蛋白质进行定量分析?

  A:蛋白质是细胞的基本功能单元,研究其功能能解释许多生物学问题。虽然基因组学和转录组学技术已经非常成熟,但离获得生物学过程的全景图还差的很远。开发一种技术能检测特定蛋白的状态,对研究其功能至关重要。蛋白质组学做为直接研究蛋白质的技术,但没有像基因组学和转录组学应用的那么广泛,蛋白质组学的检测技术也需要更多时间走向成熟,这完全可以理解,因为蛋白组学分析面对的技术挑战比核酸检测技术多的多。

  Q:什么是PASEF? PASEF为什么对于研究蛋白质组十分有用?

  A:PASEF是Matthias Mann教授实验室和布鲁克共同开发的,利用了捕集型离子淌度质谱技术,离子淌度分离与质谱联合使用不是新的技术,但TIMS不仅仅提供额外一个维度的分离,它还可以将离子进行聚焦,随后释放并进行连续碎裂,PASEF就是采用这个理念,在数据依赖性采集(DDA) 模式下达到非常快速、灵敏的谱图采集。

  Q:PASEF如何扩展DIA的能力?

  A:长期以来,我们观点一直是使用可靠的仪器获得可重复的定量结果,我们一开始利用像单反应监测 (SRM) 这样的靶向分析方法,然后扩展到DIA/SWATH,现在PASEF技术与DIA结合,又带来了很多优势。dia-PASEF的概念最一开始是由Mann实验室的Florian Meier提出,基本目的是增加离子利用率。像SWATH-MS这样的DIA方法中,只有预设m/z窗口里的离子能通过四极杆,获得碎片信息,在传统DIA方法中,离子的利用率非常低,通常只有1-3%,而在DDA的方法中则更低。dia-PASEF的理念是在离子淌度的每个循环中,四极杆的隔离与TIMS的淌度分离协同工作,这主要源于离子淌度与m/z之间的某种程度上的关联性。因此,当我们进行dia-PASEF模式时,我们可以利用更多的离子从而得到更高的离子信号强度。PASEF的优势在DDA采集中已经被广泛证明,在DIA采集中,依然能体现出优势。离子淌度提供的额外一个维度的分离,让我们几乎能接近离子选择的极限另外,TIMS对离子的聚焦让我们能即使在高速采集的时候也能保证非常好的灵敏度,从而对更低的样本量进行分析。

  Q:您是首批进行dia-PASEF工作流程研究的学者之一,为什么您决定开发此方法以及有什么需要克服的挑战吗?

  A:大约两三年前在苏黎世的时候,我们一直关注着Mann实验室和布鲁克在TIMS及PASEF上的开发进展,我们开始思考PASEF能否用于DIA,我曾多次与Hannes Röst讨论过从数据分析的角度上,我们可以做些什么。当然,那时候在Matthias的研究团队还未对PASEF用于DIA进行开发,但已经对这个问题思考的有一段时间了,意识到我们都对这个方法的开发有兴趣后,我们便展开了合作,Mann实验室在PASEF开发上有着丰富的经验及对此方法开发的强烈的意愿,Hannes有一套好的软件工具,也对这个软件可以处理这种新的数据格式充满信心,,布鲁克可以提供仪器方面的专家,协助采集方法的建立,而Ruedi跟我已经花了很多时间在DIA/SWATH方法的开发上,可以从这方面可以有所贡献,因此,我们有信心可以取得一些有趣的进展。

  在开发过程中,我们当然也遇到了一些挑战,首先就是如何建立隔离窗口,以便于在保持离子选择性和覆盖率的前提下达到良好的采集效率,这比标准的DIA/SWATH方法要复杂得多,因为增加了离子淌度这个维度,让需要优化的参数变得更多,软件的优化也付出很大的努力。我们认为我们现在已经取得了很好进展,这个方法在生物研究上已经展现了很好的应用潜力,当然,仍然还有很多空间可以优化及扩展这个方法,我们也期待进一步的研究。

  Q:在做相同的研究的前提下,您预期使用dia-PASEF具有什么好处?

  A:当然有,我们都知道,dia-PASEF方法可以运行得非常快,使用极少的起始材料仍可以得到非常好的灵敏度及定量结果,这应该是一个非常适用于蛋白复合物分析的方法。我希望我们能把这个方法转化成更常规的应用方法,当然,这是我们想在我的新实验室里探索与发展的项目。

  Q:您在哪些领域的研究中应用了基于DIA的质谱方法?

  A:我们已经研究这些方法将近十年了,并用于很多应用领域,当我们想进行高质量和完整定量蛋白质组学研究时,DIA是优于其它方法,这是这些年我们主要研究。在蛋白质组学领域中已经有许多研究团队开始转向这个方向,采用这一策略,我很开心看到这一点,虽然在许多不同领域的研究上探索是很好的,但在某些时候,在最有希望及发展性的领域进行团结合作是需要的。

  Q:除了您的研究之外,您另外开发了几个开放的资料软件,为什么您认为开发与dia-PASEF共用的资料软件很重要?

  A:在基于质谱研究的蛋白质组学里,软件工具和计算工作流程的开发一直是研究的一个关键方向,在某些方面,也是一个极大的瓶颈,我们的领域正在大力地推动数据、代码和文档的创建并且有了进展,这并不是一件容易的事,但是是一件必须要做的事,特别是我们在谈论方法开发的时候,其他研究团队必须可以在他人的研究成果上取得再现性及以此拓展到其它的研究成果。我认为布鲁克提供一个开放的数据格式和一个软件开发工具包是非常有远见的。在我接受培训的Aebersold团队中,他们通常开发尽可能开放的工具,而目前领导dia-PASEF项目软件开发的Hannes Röst也有类似的理念。

  Q:您将来的研究方向有哪些?

  A:我的实验室还在建立当中,这还需要一段时间,但是,几周前我们已经安装了一台timsTOF Pro并且已经开始做了一些测试。在我的计划中,我们实验室将有三个主要研究方向,首先,我们将继续开发定量蛋白组学方法,也就是说我们将继续推进dia-PASEF和相关策略研究;其次,我非常想要继续进行蛋白交互网络和蛋白复合物尤其是动态方面的研究,这对我来说是关键研究领域,很多关键细胞信息能通过这个研究获得,但目前的研究方法要应对这个在研究还有很长的路要走;最后,我想将前两个工作成果转化到实际应用当中,尤其是应用到先天免疫疾病中感染生物学和信号转导的研究中。


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