不是有离子淌度就可以做4D-Proteomics™

　　2020年3月10日，德国 Max Plank Institute 生化研究所的 Jürgen Cox 团队在新一期的《Molecular & Cellular Proteomics》上在线发表了研究论文《MaxQuant software for ion mobility enhanced shotgun proteomics》，文章详细介绍了 MaxQuant 利用四维信息提取，提高蛋白鉴定深度、定量完整性和准确性，新版 MaxQuant 软件专为布鲁克4D-Proteomics™开发了 4D-MBR (4D-Match Between Runs）算法，利用 CCS 值（Collision Cross Section，碰撞截面）这额外一个维度的数据对齐，可显著减少 LFQ （Label Free Quantification）的缺失值（Missing Values）并提高匹配的可信性，文中利用 208 个血蛋白组学样本对 4D-Proteomics™ 做大队列蛋白组学研究的性能进行了评估，结果显示，4D-Proteomics™ 技术可大大提高大队列样本 LFQ 的数据完整性，实验中蛋白定量数目几乎能提高 100%。

图1. MaxQuant 支持 4D-Proteomics™

　　大家应该都已经注意到，目前在蛋白质组学圈里最火热的技术就是 4D-Proteomics™ 技术了，在前几期布鲁克质谱 4D-Proteomics™ 系列微信推文中，我们也对 4D-Proteomics™ 的各种优势进行了详细介绍。4D-Proteomics™ 的核心是离子淌度技术被引入蛋白质组学分析中， 离子淌度分离与色谱和质谱的联合使用，可以提供最高峰容量。

　　既然 4D-Proteomics™ 的核心是离子淌度技术，那是否只要有离子淌质谱就可以做 4D-Proteomics™ 呢？

　　显然不是，接下来我们就来聊一聊 4D-Proteomics™ 必须具备的条件。

　　01 CCS值能被可靠并高度重复测定

　　在4D-Proteomics™的算法中，除了像传统的蛋白质组学一样提取保留时间（Retention Time）, 质荷比（m/z）、离子强度（Intensity）外，还需要提取CCS值（Collision Cross Section，碰撞截面）用于数据对齐和定量。

　　CCS值做为离子淌度的一个关键参数（图2A），它与离子的结构大小有关系，是离子的一个物理常数，因此可以用于离子的定性和定量分析。目前各个质谱厂家都推出了商品化的离子淌度质谱，所采用的离子淌度技术也各不相同，主流的离子淌度技术有四种：迁移管离子淌度（DTIMS）、行波离子淌度质谱（TWIMS），高场非对称波形离子淌度（FAIMS）和捕集离子淌度（TIMS），虽每种淌度技术各有其特点，但并不是所有的类型都能测定出CCS值，即使能测定出CCS值，还需要考虑CCS的测定准确度如何! 重复性如何!

图2：A，CCS与离子的结构大小有关系；B，timsTOF Pro能精准并高度重复测定CCS值

　　02 离子淌度模式不能影响质谱灵敏度

　　更高灵敏度的检测设备一直是蛋白质组学研究者所追求的，质谱灵敏度是决定蛋白检测深度的关键参数之一。离子淌度的提供的额外一维度的分离，与 LC-MS 方法联用确实能提高峰容量， 但传统离子淌度质谱淌度分离打开，因各种原因造成离子利用率（Duty Cycle）下降，从而造成质谱的灵敏度下降，这也是离子淌度技术发展这么多年，一直没能成功应用于大规模蛋白组学的原因。

　　布鲁克 timsTOF Pro 采用全新的离子淌度技术 TIMS (Trapped Ion Mobility Spectrometry)，在空间和时间上对离子进行聚焦（图3），分布在 100ms 时间跨度的离子，被聚焦到 5ms，再结合离子淌度质谱特有的单电荷背景离子过滤功能，timsTOF Pro 的灵敏在淌度模式下能被提升 20-50 倍，这个性能是 TIMS 离子淌度技术特有的。

图3：TIMS 提高 timsTOF Pro 灵敏度原理图

　　03 离子淌度模式下也能实现高速扫描

　　扫描速度是提高蛋白覆盖深度的另一关键参数，用户在质谱参数表中看到的扫描速度大多数为仪器极限扫描速度，为了平衡灵敏度，实际样本分析时采用的扫描速度常常比参数低的多（比如有些质谱最高扫描速度标称 100 Hz，实际样本分析只有 20-30 Hz），因为这个原因，使很多高分辨质谱不适合做深度覆盖蛋白组学研究。

　　timsTOF Pro 采用的 TIMS-PASEF 扫描方法(图4)，每 100 ms 可以采集超过 100 张二级谱图，实际样本分析时，二级扫描速度平均为 120 Hz，这让 timsTOF Pro 也成为二级扫描速度最快的质谱仪。

图4: TIMS-PASEF 扫描循环

　　04 数据解析软件支持4D-Proteomics流程

　　性能再好的质谱仪器，也离不开软件的数据深度挖掘，4D-Proteomics™ 比传统的蛋白组学流程多一个维度的信息，这意味着数据处理软件也需要能读取离子淌度信息，目前布鲁克已经与多个蛋白组学软件开发公司（BSI，Protein Metrics，Biognosys，Matrix Science，GeneData 等）和研究团队（德国 Max Plank 研究所 Jürgen Cox 团队，美国密歇根大学 Alexey Nesvizhskii 团队，美国华盛顿大学 Michael MacCoss 团队）深度合作，以尽可能挖掘 4D-Proteomics™ 的优势。

图5：4D-Proteomics™ 软件支持

　　离子淌度分离技术被引入蛋白组学研究已经在各个方面显示出独有的优势，随着布鲁克对蛋白组学方案的投入不断加大，4D-Proteomics™必将越来越完善，也必将代表蛋白组学的发展方向。

　　参考文献：

　　 Nikita Prianichnikov, et al., MaxQuant software for ion mobility enhanced shotgun proteomics, Molecular & Cellular Proteomics, 2020.

　　 lorian Meier, et al., Online Parallel Accumulation–Serial Fragmentation (PASEF) with a Novel Trapped Ion Mobility Mass Spectrometer, Molecular & Cellular Proteomics, 2018.