独辟蹊径：基于MALDI成像的空间代谢流分析策略

1前言
瓦博格效应（Warburg effect）被认为是肿瘤代谢的一大特征，其内在机制十分复杂，虽近年来的研究提出并证实了相应的一些调控机制，但依然还有很多疑问亟待解决，因此，研究瓦博格效应中关键的调控节点有助于揭示肿瘤细胞转移的机制，为肿瘤的靶向性治疗提供很好的方向和策略。目前，肿瘤细胞中如何通过三羧酸（TCA）循环将葡萄糖转化为乳酸盐仍不明确，虽然磁共振波谱（MRS，Magnetic Resonance Spectroscopy）和正电子发射断层扫描（PET，Positron Emission Topography）等技术已广泛应用于肿瘤代谢通路的研究，但在通量上仍有一定的局限性。本文以MALDI质谱成像为主要分析技术，结合¹³C稳定同位素示踪法，直接呈现出胶质母细胞瘤中¹³C₆-葡萄糖的TCA代谢物的空间分布，有效地揭示了胶质瘤组织中TCA循环活性的下调特征。

2实验方法

取病人来源的异种移植（PDX）的小鼠分别在0min和30min通过腹腔引入¹³C₆-葡萄糖，在60min后宰杀小鼠并获取器官，制备小鼠脑胶质瘤组织的冷冻切片。将胶质瘤切片转移到导电载玻片上，使用HTX M3+自动化基质喷涂仪喷涂N-(1-萘)乙二胺盐酸盐（NEDC）基质。通过timsTOF fleX MALDI-2、在负模式下进行20µm空间分辨率的MALDI成像实验，使用SCiLS™ Lab 2023a进行数据可视化，并在MetaboScape^® 2023a进行分子注释。在SCiLS REST API通过R语言提取母离子和所有碳同位素的强度信息。

图1. 基于MALDI质谱成像的分析流程

3实验结果与讨论

图2. A) 空白组和给药组切片的光学图片，其中深色区域为肿瘤；B) 空间聚类分析划分的肿瘤区域和健康区域；C) 苹果酸盐[M+0]峰的离子热图；D) 苹果酸盐[M+1]峰的离子热图；E)主成分分析得分图。

MALDI成像常常产生海量的数据，需要借助专业的软件才能实现有效的数据挖掘。布鲁克推出的SCiLS Lab软件，集数据分析和数据可视化为一身。首先，SCiLS Lab对空白组和给药组的鼠脑胶质瘤组织的成像数据进行空间聚类分析，将组织根据分子组成的差异性进行区域划分。如图2B所示，空白组切片可以划分为橙色和绿色两个区域，分别对应肿瘤区域和健康组织区域，而在给药组切片中，划分的蓝色和黄色区域分别是健康组织区域和肿瘤区域。在此基础之上，通过SCiLS Lab的“空间共定位”功能，可以进一步筛选出在肿瘤区域具有高表达的分子。图2C和2D为苹果酸的M+0和M+1峰的离子热图，苹果酸在空白组和给药组的肿瘤切片中均具有显著表达。由于健康组织和肿瘤组织具有不同的分子表型，因此基于MALDI成像得到的分子图谱可以快速地识别出空白组和给药组中肿瘤区域。

图3. 空白组和给药组中肿瘤区域和健康区域差异性分析得到的ROC曲线

通过SCiLS Lab中的ROC分析、T检验可以快速筛选并验证肿瘤组织和健康组织的差异性分子。图3为ROC分析找到的差异性分子，AUC值越高，差异越明显。以柠檬酸（m/z 191.0195）、谷氨酸盐（m/z 146.0469）等为例，作为TCA循环中的重要代谢产物，它们均可以有效地区分空白组和给药组中的肿瘤区域和健康区域。

图4. TCA循环中代谢物的离子热图

此外，SCiLS Lab还提供了API扩展功能接口，可以方便用户进行更灵活的数据处理。在本文中，通过R语言将所有母离子以及碳同位素的强度信息提取出来，从而对肿瘤组织中TCA循环中代谢物进行定量分析。图4为TCA循环中典型代谢物的离子热图，参与循环的苹果酸等在肿瘤区域的空间表达显著高于健康组织区域。图5为在¹³C₆-葡萄糖摄入后，乳酸和苹果酸对应的代谢产物M+0、M+1、M+2、M+3和M+4的同位素相对强度比值；与健康组织相比，肿瘤组织中M+0的比例更高，而M+2、M+3和M+4的比例较低。结合上面两部分数据，说明胶质瘤组织较健康区域TCA循环的活性发生显著下调。

图5. 健康-空白组、肿瘤-空白组、健康-给药组和肿瘤-给药组中TCA代谢物的相对强度比值（数据经过LC-MS验证）

4结论

本文展示了基于布鲁克timsTOF fleX MALDI-2质谱仪的空间代谢流分析流程。timsTOF fleX MALDI-2质谱仪可以实现高空间分辨率的质谱成像数据采集，配套的SCiLS Lab软件具有多元化统计分析功能和API扩展接口功能，可以对MALDI成像数据进行深入的分子信息挖掘。与传统组学流程相比，MALDI成像独特的“定位功能”优势能够获取动态条件下某一代谢通路在组织某个部位的含量变化，为理解肿瘤代谢过程提供了直观、全面的动态分析视角，将对肿瘤的空间代谢研究工作起到极大的推动作用。