聚糖分子的空间组学解决方案

正如基因组学和蛋白质组学给转化研究带来了革命性的推动作用一样，糖组学也带来了同样的前景，特别是在免疫学和病理学领域。众所周知，N-糖基化能促进蛋白质折叠、蛋白质运输以及信号转导。另一方面，已证明N-糖分子在癌症、免疫疾病和神经退行性疾病等疾病状态下会发生相应的改变。因此，它们是非常值得关注的疾病标志物，可以为临床医生提供帮助，加速疾病诊断。

在本文的示例中，我们展示了MALDI成像能够揭示组织类型内和跨组织类型病理特征所对应的空间聚糖谱。具有特定分子结构的聚糖在肝肿瘤、肝间质、乳腺肿瘤或乳腺间质中更丰富，而其他聚糖分子在不同类型的肿瘤中同时呈现异常的空间表达，为肿瘤微环境提供了更通用的分子标记。该示例显示了在糖组学这个新兴领域中，有大量的、与疾病病理状态密切相关的生物信息正等待进一步的发掘。

 实验方法        

a) FFPE组织样本抗原修复
首先，对附着在 IntelliSlides^® 导电玻片上的FFPE 组织进行脱蜡，60°C 孵育 1 h，然后依次浸泡在新鲜的二甲苯（3 min，2x）、100% 乙醇（1 min）、Carnoy溶液（3 min，2x）、95%乙醇（1 min）、70% 乙醇（1 min）和 HPLC 级超纯水（3 min，2x）。干燥后，将组织在柠康酸缓冲液（pH=3）中加压加热（95 °C，20 min）以进行抗原修复。

b) PNGase F 喷涂方法

HTX M5 TM-Sprayer 基质喷雾仪用于 0.1 mg /mL PNGase F（糖苷酶 F，FPNGase F Prime Ly，N-zyme Scientifics）的喷涂，参数设置为：泵流速 25 µL/min，15 层，喷头移动速度 1200 mm/min，喷头加热温度 45°C，喷头气流速 10 psi，喷涂作业时运行轨迹的间距3 mm；喷头到样品表面的距离 40 mm。喷涂 PNGase F 后，将组织转移至温湿度箱中、37.5°C 下孵育 2h，使酶活化。

c) 基质喷涂方法

酶解完成后，HTX M5 TM-Sprayer 基质喷雾仪用于 7 mg/mL CHCA基质（α-氰基-4-羟基肉桂酸基质，溶于 50% 乙腈和 0.1% 三氟乙酸中）的喷涂，参数设置为：泵流速 100 µL/min，10 层，喷头移动速度 1200 mm/min，喷头加热温度 79°C，喷头气流速 10 psi，喷涂作业时运行轨迹的间距 2.5 mm；喷头到样品表面的距离 40 mm。

d) 仪器参数设置

MALDI 成像使用 timsTOF fleX 在正离子模式下进行，质量范围设置为 700-4000 Da，transfer time 为 130 µs，pre pulse storage 为 30 µs，空间分辨率为 150 µm ，每个像素点 300 shots。

e) 查看数据
数据统计分析与分子注释分别使用 SCiLS™ Lab 2023b 和MetaboScape^® 2023 软件。

 结果和讨论    

本实验成功展示了应用 MALDI 成像的方法对经过 PNGase F 处理后的肝脏和乳腺肿瘤组织中聚糖分布的研究。通过 SCiLS Lab 软件查看两个不同肿瘤组织的平均质谱图，图 1 中展示了高质量的质谱数据和清晰的信噪比，从而实现精确的峰拾取。

图1. （A）肝肿瘤（左上）和乳腺肿瘤（左下）组织切片的光学图像，
（B）肝肿瘤组织 MALDI 成像的平均质谱图，（C）乳腺肿瘤组织MALDI 成像的平均质谱图。

SCiLS Lab 软件用于成像数据的统计分析。通过执行无监督的空间聚类分析，它会根据分子组成的相似性、划分不同的 “区域” ，分子组成相似的用相同的颜色表示。图 2 显示了肝脏和乳腺肿瘤组织的空间聚类分析结果，将该结果与病理学家通过 H&E 染色所做的组织学注释相匹配，发现肝肿瘤对应于橙色区域（图 2A），乳腺肿瘤对应于蓝色区域（图 2B）。

图2. （A）肝肿瘤组织的空间聚类分析结果（左），H&E 染色结果（右）；
（B）乳腺肿瘤组织的空间聚类分析结果（左），H&E 染色结果（右）。

基于上述的区域定义，使用 SCiLS Lab 软件工具中的空间共定位（Find Values Co-Localized to Region）功能，可以找到在该区域具有高表达的、区别于正常组织的 m/z 特征分子（聚糖），这些特征分子可作为肿瘤标志物的候选分子。筛选出的 m/z 特征分子可以进一步导入至MetaboScape软件中、与聚糖数据库进行匹配（该数据库是 Rick Drake 及其团队一起为 MetaboScape 软件开发的聚糖分子数据库）。通过 MetaboScape 的分子注释，识别了多个不同的聚糖分子，如表 1 所示。注释后的特征性分子可以重新导回到 SCiLS Lab 软件中，以实现这些分子在肿瘤组织的空间分布可视化。

表1. MetaboScape 注释的聚糖分子

带有特征分子注释的MALDI成像热图显示，特定分子结构的聚糖在单一组织类型或跨组织类型的病理区域中具有独特的空间表达。从图3中可以看出，有些聚糖在肝肿瘤（图3A）、肝间质（图3B）、乳腺肿瘤（图3C）或乳腺间质（图3D）中分别呈现出更高的空间表达；还有些聚糖在两种肿瘤之中都有显著的高表达（图3E），可认为是更通用性的候选肿瘤标志物。

图3. 不同聚糖在肝肿瘤组织（左图）和乳腺肿瘤组织（右图）中的空间分布情况。
（A）m/z 1485.535在肝肿瘤中高表达，（B）m/z 1743.581在肝间质中高表达，
（C）m/z 2174.774在乳腺肿瘤中高表达，（D）m/z 2012.725在乳腺间质脂肪细胞中高表达。
（E, F）聚糖m/z 1663.585和1298.447在两种肿瘤类型中均具有较高的空间表达。

 结论              

布鲁克的 timsTOF fleX 平台具备高分辨的 MALDI 质谱成像功能，可以实现 PNGase F 酶解后的组织中聚糖分子的空间可视化分析。布鲁克还提供先进的成像数据统计分析软件 SCiLS Lab，通过无监督的空间聚类分析，可以在分子水平标注肝脏和乳腺组织中的肿瘤区域及癌旁区域，进一步通过 SCiLS Lab 软件的空间共定位分析功能以及  MetaboScape 软件的分子注释功能，可以找出区域的特征性分子并进行分子信息注释。

 参考文献

[1] Drake RR, Powers TW, Norris-Caneda K, Mehta AS, Angel PM (2018). In Situ Imaging of N-Glycans by MALDI Imaging Mass Spectrometry of Fresh or Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue. Curr Protoc Protein Sci. 94(1):e68. doi: 10.1002/cpps.68. Epub 2018 Aug 3. PMID: 30074304.