多维定性定量，OligoQuest攻克核酸药物杂质分析难题

发布时间： 2023-12-15 11:52 来源：布鲁克（北京）科技有限公司-质谱仪器

核酸药物，是继第一代小分子药物，第二代抗体与蛋白药物后，被称为“第三代药物革命”的药物。其中合成寡核苷酸类，作为治疗多种类型疾病的活性药物成分（active pharmaceutical ingredients, API），日益受到人们的关注。

但是，目前寡核苷酸类药物种类繁多，性质多样，如ASO，siRNA，micro-RNA等。而且合成步骤繁琐，通常合成25个碱基的序列，甚至需要超过100步的化学反应来进行。因此对寡核苷酸类药物进行质量控制，不但需要对主产品的序列准确度、纯度等进行分析，也需要对在合成过程中可能产生的多样副产物/杂质等进行分析

布鲁克在核酸药物杂质分析领域拥有完整的解决方案。该解决方案结合了超高效液相色谱（UHPLC），TIMS离子淌度高分辨质谱或QTOF高分辨质谱，以及Biopharma Compass合规软件等，在提供丰富核酸药物信息的同时，采用Biopharma Compass软件套装中的OligoQuest软件多样流程，可以多维定性定量核酸药物的预期及非预期杂质。

OligoQuest

>>OligoQuest autoMSMS流程

对主产物及预期副产物，通过完整分子量、同位素分布、碎片离子等信息进行确证，同时可通过LC-UV/MS图谱定量其纯度

>>OligoQuest targetedMSMS流程

对于低含量副产物及非预期副产物，该流程可提高鉴定深度。利用类似于MRM的分析策略以及高质量的MS/MS谱图，即使像U/C互换这样仅1 Da差异的不同副产物，也可以依靠布鲁克timsTOF或者QTOF高分辨质谱系统的同位素高置信度准确确证。

以24 mer经甲基化修饰的寡核苷酸实际样品为例（为书写简便，后文中其序列组成以a、c、g、u简写），我们来看如何利用OligoQuest软件进行寡核苷酸类药物的质量控制。

1. 主产物分析

通过OligoQuest autoMSMS流程，软件会自动给出主产物及预期副产物等的鉴定匹配结果，如分子量、质量精度、相对峰面积百分比、保留时间、序列覆盖度、MSMS匹配得分等信息（如下图）。

通过LC-UV/MS谱图，软件可自动给出主产物及副产物的相对峰面积百分比。如下图，9.28 min的主产物相对峰面积百分比是93.4%，而其它副产物相对峰面积百分比为0.7%-2.5%。

通过软件的同位素匹配功能（如下图），可将主产物的实测同位素分布与理论同位素分布，进行重合比对确证，并且也有助于观察是否发生C/U互换等。

对于序列确证，软件可以从5‘端（红色块）和3’端（蓝色块），在单核苷酸等水平，进行核酸序列的多维确证，相应的质量精度（ppm）在色块上直接进行了注释。对于红色或蓝色块，软件会依据相应的信号强度，以热图形式呈现不同深浅，从而引导用户对较弱的离子信息进行进一步确证。

相应每一个相关的MS/MS信息，都可以通过交互界面，查看原始谱图与理论谱图的对比（如下图示例，红色为理论预测，蓝色为实测谱图）。

与此同时，还可以在软件中设置多质量属性监控MAM模块，快速对样品进行质控。如下图，通过设置质量精度、序列覆盖度等5种质量属性，软件通过“红绿灯”形式快速告知相关质量属性是否通过测试。

2. 副产物分析

1）预期副产物分析

通过OligoQuest autoMSMS流程，设置主产物序列信息（5OH c a c g c g u g c u u u u g c a c g g c g u g c 3OH），及可能发生的变异，如碱基缺失（-c），碱基增加（+g），碱基互换（a/g、a/c、u/c等），软件自动找出如下副产物：mod3-c1、mod3+g1、mod3>> [a,g]16、mod3>>[u,c]、mod3>>[a,c]2。

对于有多种序列可能性的副产物，通过软件的序列确证功能可进行快速指认。如下图，对于发生a/g和a/c碱基互换的2个副产物，通过序列匹配度，可将其指认为a16g和a2c。

2）非预期副产物分析

在对-c1的副产物分析时，发现有一个变异体仅相差1 Da，并且在UHPLC上共洗脱，autoMSMS数据难以获得足够的序列信息对其确证（下图A）。

通过OligoQuest targetedMSMS流程，对这两个副产物进行分析，获得匹配度更好的序列信息，从而可指认出-c1的副产物（下图B），以及在-c1副产物基础上进一步发生u/c互换的变异体mod3-c1,u9c（下图C）。通过高准确度的同位素信息，我们还可以得出共洗脱色谱峰中两种副产物的比例：mod3-c1 22%，mod3-c1,u9c 78%。

由此可见，通过OligoQuest软件中autoMSMS和targetedMSMS流程，可对核酸药物主产物、预期及非预期副产物进行准确的定性定量分析。targetedMSMS流程不但能增加序列分析的深度，也可以表征发生多步变异的副产物，从而帮助用户更加全面的掌握样品中副产物/杂质的信息。