空间脂质组学结合多重免疫蛋白成像揭秘肿瘤的异质性

胶质母细胞瘤是一种最常见且高度恶性的原发性脑肿瘤，五年存活率低于10%。目前，大部分的研究工作主要集中在胶质母细胞瘤的代谢紊乱方面；在空间尺度上评估肿瘤内异质性和肿瘤微环境的报道很少。在肿瘤的病理研究中，使用最广泛的空间表征手段是免疫组化（IHC）技术，而其在检测通量方面具有一定的局限性，因此迫切需要一种更高通量的分析方法。MALDI HiPLEX-IHC，即多重免疫蛋白成像，是布鲁克公司与Ambergen公司合作推出的抗原检测结合MALDI质谱成像的综合性空间蛋白分析方案。本文基于布鲁克timsTOF fleX空间组学质谱仪对胶质母细胞瘤同时进行了空间脂质组学分析和MALDI HiPLEX-IHC表征，实现了肿瘤的蛋白表达图谱与代谢活动的空间关联性分析。

实验与方法

选取三块来自三名不同的胶质母细胞瘤患者的肿瘤组织样本和一块来自星形细胞瘤患者的肿瘤组织样本，并制备成新鲜的冷冻切片。将肿瘤组织样本一分为二：取一部分切片进行匀浆处理，然后通过叔甲基丁基醚（MTBE）对肿瘤中的脂质进行提取，在timsTOF fleX上进行LC-MS/MS实验；另一部分样本制备成像组织切片，将timsTOF fleX切换至MALDI成像模式，在开启TIMS离子淌度分离的条件下进行20µm的高空间分辨质谱成像数据采集，以获取脂质分子的空间分布信息。随后在MetaboScape^®软件中依据m/z和CCS信息对MALDI成像数据进行分子信息注释; 将基质冲洗后，对同一块组织切片，采用Ambergen染色流程^[1]进行六分子通道的MALDI HiPLEX-IHC工作流程，使用的抗体探针分别GFAP，Vimentin、Ki67、CD68、CD4和Collagen 1A1。

结论

MALDI HiPLEX-IHC描绘出四个肿瘤组织中蛋白标志物的特异性分布，从而揭示出其不同的细胞组成。图3为肿瘤标志物GFAP和巨噬细胞标志物CD68的MALDI成像离子热图与H&E染色结果的对比，可以看到胶质细胞和免疫细胞在四个肿瘤组织中呈现出差异性的空间分布特征：胶质细胞分布比较均匀，而免疫细胞则相反；CD4 T细胞在肿瘤组织区域含量较高，而部分巨噬细胞与Collagen 1在肿瘤内的圆形区域的空间分布具有一定的相似性，即呈现出一定的“空间共定位”效应，并推测圆形区域可能是干细胞。

图4展示的是在SCiLS™ Lab软件中，将空间脂质组数据与MALDI HiPLEX-IHC结果进行联合分析，可以看到一些脂质和代谢产物与巨噬细胞、B细胞和星形细胞共定位，表明了不同类型的细胞具有独特的脂质和代谢分子空间组成。

总结

本实验基于timsTOF fleX空间组学质谱仪，首先对胶质母细胞瘤样本进行了空间脂质组学分析，实现了约300个脂质分子的可靠空间注释。随后对同一块切片进行了MALDI HiPLEX-IHC表征，并将脂质分子的成像热图与蛋白质分子的成像热图进行空间共定位分析，从而在空间维度实现了肿瘤异质性、细胞构成、蛋白及脂质分子特异性分布的联合分析，为肿瘤异质性的综合性研究提供了全新的分析策略。