赖氨酸偶联ADC药物LC-MS表征的正交技术

赖氨酸偶联ADC药物

LC-MS表征的正交技术

简介    

方法    

完整水平的DAR测定

使用固定在磁珠上的 PNGaseF ，在 PBS 中， 37°C 30 分钟，自动对曲妥珠单抗美坦新进行去糖基化。在配备了 Waters™ BioResolve™ RP mAb 柱 (2.1 x 50 mm) 的 Waters™ BioAccord™ 系统上，通过反相 LC-MS 对所得样品进行完整分子量水平分析。

ADC样品的胰蛋白酶水解

使用固定在磁珠上的 PNGaseF ，在 PBS 中，样品在 5 M Gnd-HCl、3 mM DTT 中，于室温下还原变性 30 分钟，然后用 7 mM IAA 烷基化 20 分钟。通过添加 14 mM DTT 猝灭 IAA，并用 RapiZyme 胰蛋白酶水解缓冲液 (Waters) 将溶液稀释至 0.6 M Gnd-HCl。以 1:5 的比例添加 RapiZyme 胰蛋白酶 (Waters)，然后在 37°C 下水解 2 小时。通过添加0.1%乙酸终止反应。所得肽在 Waters™ ACQUITY Premier CSH C18 色谱柱 (2.1 x 150 mm) 上进行分离，并在 Bruker Impact II QTOF 质谱仪上进行 MS/MS 分析。

ADC样品的RgpB水解

样品在 7.9 M 尿素、5 mM DTT 中于 30°C 还原变性 30 分钟，然后用 10 mM IAA 烷基化 30 分钟。通过添加 11 mM DTT 猝灭 IAA，并将浓度调整至 1 mg/ml 抗体和 6 M 尿素。以 1:50 的比例添加 RgpB，然后在 30°C 下水解 4 小时。通过添加1%甲酸终止反应。所得肽在 Waters™ BioResolve™ RP mAb 柱 (2.1 x 150 mm) 上分离，并在 Bruker Impact II QTOF 质谱仪上通过 MS/MS 进行分析。

体外血浆稳定性测定

曲妥珠单抗美坦新在牛血浆中于 37°C 孵育 24-48 小时，ADC 浓度为 0.2 mg/ml。通过亲和捕获分离 ADC，并根据上述方案制备用于 MS 分析。

数据处理

分别使用 Protein Metrics Byos^® 中的 ADC 和 PTM 模块来处理完整分子量和肽图谱的原始数据。

完整分子量分析和DAR计算

在血浆中孵育后观察到 DAR 降低，蓝色阴影区域显示肽图数据重建的完整分子量信息。

酶切特异性

为了评估 RgpB 的特异性以及准确检测和鉴定水解产物的能力，使用未偶联的曲妥珠单抗进行对照酶切。

仅从精氨酸末端肽观察到完全覆盖，并且未观察到赖氨酸处的酶切，显示出高特异性。

Byos 中的 PTM 模块使用Byonic™ 搜索引擎根据 MS2 光谱鉴别肽。所有精氨酸末端肽均基于 MS2 碎片离子进行可靠鉴定

最长肽是根据上图所示带注释的 MS2 谱图确定的。MS1 同位素图进一步验证了这一鉴定。绿色条显示理论（基于平均）同位素分布

胰蛋白酶和 RgpB 水解特点的比较

肽覆盖图 – 胰蛋白酶水解

肽覆盖图 – RgpB

RgpB 水解完全覆盖了所有含有赖氨酸的肽。此外，水解谱图被简化，因为存在不同的肽形式，包括未偶联的、与一种药物偶联的（在多个位点）以及与两种药物分子偶联的

相关肽偶联水平的比较

该表显示了对照和孵育血浆样品之间偶联（非位点特异性）和未偶联肽的标准化 XIC 面积的比较。出于报告目的，隐藏了未偶联肽的百分比。

ADC模块将使用该定量信息以执行完整分子量的重建。在此过程中，氨基酸水平的偶联相互卷积以重建理论上的完整分子量质谱。将理论重建的完整质谱与实验光谱进行比较，提供了一种将肽图谱数据与完整分子量分析进行比较的方法。然后可以使用两个光谱之间的差异来比较两种方法之间的相关性。

位点占用率定量

在此示例中，三种肽型被准确地鉴定并定量。Delta Mod.Score确认了修饰位点，分数是根据两个可能位点之间是否存在 MS2 碎片离子来计算的。该表显示了基于归一化 XIC 面积的每种肽型的相对量。

结论