磁共振质谱（MRMS） 探索隐藏在指纹中的代谢世界

人的指纹中含有丰富的和代谢物及外源性物质有关的化学信息，包括药物、化妆品、滥用药物和爆炸物，磁共振质谱将帮助我们建立指纹特征和分子信息的联系。

通过磁共振质谱（MRMS）解析了指纹中极其复杂的分子组成，得到的数据可用于识别个体性别和年龄范围。更有意义的是发现了区分差异的特异代谢产物，从而建立了代谢组与性别和年龄关系的生化基础。

指纹对每个人来说都是独一无二的，由复杂的指纹纹理构成，在法医学中个体识别至关重要^[1]。微观图像方法基于表皮指纹模式并与 AFIS（自动指纹识别系统）数据库或者与嫌疑人的指纹直接比较。然而，在没有可以识别的指纹痕迹情况下，对其化学成分的解析可以发现个体的性别和年龄范围，以及其他具有法医价值的信息。事实上，指纹含有内源性代谢物和外源物质如药物、药物、个人护理产品和食品添加剂等成分。由于肉眼看不到潜在的指纹，因此必须使用专门的试剂来显示，而这可能会干扰后续的成分分析^[2]。为了解显示试剂对组成检测的干扰，我们使用了速溶指纹粉末来发现在无孔和半多孔表面上的潜在指纹。

考虑到人类指纹化学成分的高度复杂性以及显示粉末的可能干扰，使用 MRMS 超高分辨率质谱是最适合的分析方法。MRMS 超高质量分辨率非靶向代谢组学可鉴定数百种代谢产物，即使存在速溶显示试剂。使用 MRMS 分析指纹，揭示了化学成分以及与性别和年龄范围相关的隐藏信息。

这项研究获得了葡萄牙里斯本大学科学院伦理委员会的许可，采集了来自 20 至 55 岁的男性和女性志愿者的指纹。

实验方法首先从人类指纹中提取代谢产物。志愿者清洁手指，并将指纹沉积在干净的载玻片中，在沉积后 60 分钟收集指纹。为了显示指纹，在指纹上涂抹速溶指纹显示粉末。用甲醇/水溶剂从显示和未显示指纹中收集指纹残留物。加 1:1 甲醇/水溶液于指印区域，洗涤样品数次并回收在干净试管中。向样品管中加入甲醇/水，离心吸取上清液进行分析。每个受试者收集三份样品并用 MRMS 分析。每个样品用甲醇/水稀释 10  倍，并添加人亮氨酸脑啡肽作为内标。

指纹提取样品在布鲁克 7T solariX XR MRMS 采用直接进样和电喷雾正模式（ESI+）分析。在质量范围 100-1500 和分辨率 680000（m/z 200）采集数据，得到整个质量范围每个化合物的精细同位素峰。采集高分辨数据时使用亮氨酸脑啡肽标品和样品中存在的高含量分子进行内标校正。

数据分析使用布鲁克 MetaboScape^® 5.0 代谢组学软件和 T-ReX^® 2D 算法，得到所有样品的质量峰列表，峰强度用亮氨酸脑啡肽归一化。SmartFormula 给出每个质量的分子式，使用人类代谢组数据库 HMDB^[3] 对代谢物进行标注。共获得 4050 个分子特征，其中 465 个通过 HMDB 数据库检索 得到鉴定，3479 个通过 SmartFormula 给出了公式。

MetaboScape^® 5.0 对数据作了进一步的多变量统计处理，进行了主成分分析（PCA）和偏最小二乘分层聚类（PLS-DA）判别分析，以确定能更好地区分男性和女性个体的化合物。PLS-DA 计算给出了预计的可变影响因子（VIP）和 区分男女个体最特异的代谢物。

MRMS 对指纹提取物的非靶向代谢组学分析和统计学分析，在 PCA 评分图中观察到男性和女性个体以及两个定义的年龄组之间的明显分离，而同一样本的重复基本一致（图2A）。分层聚类进一步证实了这种分离和数据的高重现性（图2B）。分离趋势表明了人类指纹 MRMS 谱的多变量统计分析可以有效的区分性别和年龄组。

用速溶指纹试剂的显示和未显示的样品之间没有观察到差异（图2B，C），表明显示剂不会干扰指纹恢复和 MRMS 的化学成分鉴定。

为了确定区分性别和年龄贡献最大的代谢产物，将 PLS-DA 模型对 MS 强度拟合，建立了一个组分系统，最大化男性/女性和 20-3/45-55 岁组间的协方差。

图2: 指纹样本代谢组学数据多变量统计分析：A. 前三个主要成分的PCA分析（蓝色，男性样本；粉色，女性样本）；B. 分层聚类分析（蓝色，男性捐赠者；粉色，女性捐赠者；V，志愿者；NR，未披露；R，披露）；C. PCA分析使用前两个主成分（蓝色，男性供体；粉色，女性供体；三角形为未显像指纹；开放圆圈为显像指纹）；D. PLS-DA模型计算区分性别的变量重要性（VIP）；E. PLS-DA模型计算区分年龄的变量重要性（VIP）

鞘脂十六碳鞘氨醇（C₁₆H₃₅NO₂，m/z 273.267312）显示出最高的 VIP 评分（图2D，E），对性别和年龄区分贡献最大。另一种有最大贡献的成分是植物鞘脂（C₁₈H₃₉NO₃，m/z 318.30027），计算和 HMDB 检索给出了分子式和鉴定（图2D，E）。MRMS 的超高分辨率、质量精度和动态范围，可以识别十六烷鞘氨醇和植物鞘氨醇同位素分子，给出明确的分子式（图 3C、D、E 和图 4C、D、E）。两种鞘氨醇的分子式还通过其同位素精细结构得到证实（图 3D 和图 4D）。

图3：十六烷鞘氨醇谱图和精细同位素分布。十六烷鞘氨醇谱图, A. 按性别；B. 所有样品；C. 碳十六烷结构和精细同位素分布; D第二 和E第三峰值。黑线是实验值；绿线是理论同位素分布。

图4：植物鞘氨醇谱图和精细同位素分布。植物鞘氨醇谱图: A. 按性别；B. 所有样品；C. 植物鞘氨醇结构和精细同位素分布; D第二和E第三同位素峰值。黑线是实验值；绿线是理论同位素分布。

女性的差异更明显（图 3B 和图 4B ），在女性指纹（图 3A 和图 4A）和同性年轻人中检测到高浓度的十六烷鞘氨醇和植物鞘氨醇。十六烷鞘氨醇是鞘磷脂（神经酰胺磷胆碱）的一种成分，存在于人体表皮。植物鞘氨醇，也存在于神经酰胺中，刺激人类角质细胞的分化^[4]，促进人体皮肤屏障中的水分^[5]，对防止脱水以及微生物和过敏原侵入至关重要^[6]。

用超高分辨率磁共振质谱法对人类指纹进行非靶向代谢组学表征，可以准确区分个体的性别和年龄。鞘磷脂在区分性别和年龄中起着核心作用。白色指纹显示试剂不会干扰皮肤表面残留物分析，指纹显示和未显示样品的化学成分非常相似。MRMS 人类指纹代谢组分析可以为法医学提供重要贡献。

参考资料

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[5] Choi HK, Cho YH, Lee EO, Kim JW, Park CS, 2017. Phytosphingosine enhances moisture level in human skin barrier through stimulation of the filaggrin biosynthesis and degradation leading to NMF formation. Archives of Dermatological Research 309(10):795-803.

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