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工商注册信息已核实!近年来,蛋白质组学在质谱技术的驱动下得以快速发展。特别是随着离子淌度技术成功的应用,为蛋白质组学发展带来了革命性的突破,随着4D-蛋白质组学技术横空出世,各个领域的专家学者取得了丰硕的成果。但是基于质谱技术的蛋白质组学研究仍面临严峻的挑战,如面对大队列样本的分析中,如何保证数据的高度重复性以及完整性,仍是亟待解决的问题。
01 传统DIA技术与DDA技术的优势与不足
目前蛋白质组学主流的数据采集模式是DDA(Data-dependent Acquisition,数据依赖采集模式)以及DIA(Data-independent Acquisition,数据非依赖采集模式)。在DDA中,仪器根据扫描的一级谱图MS1中各个离子信号强度进行排序,选择强度在前N名的母离子进行二级碎裂。但是这种方式的缺点是高丰度组分严重影响检测结果、特别是对大队列样本的检测重复性差。DIA技术是将质谱全扫范围分为若干个窗口,能够将每一个预设的隔离m/z窗口中的每一个母离子都进行二级碎裂,获得碎片信息,因此数据利用率大大提高,缺失值减少。传统的DIA技术虽然能够全面的扫描样本离子信息,但是谱图十分复杂,让谱图的解析成为了另外一个挑战。虽然可以通过设置更窄的隔离窗口降低谱图的复杂度,但是对应的隔离窗口数目会变多,从而导致DIA扫描的循环时间变长。同时,由于一个前体离子在一个循环时间内仅被扫描一次,所以离子的整体利用率会下降。
02 dia-PASEF技术的诞生
为了弥补传统DIA技术的不足,在Matthias Mann教授及Ruedi Aebersold教授等多个团队的强强联手下,基于TIMS(捕集离子淌度谱,Trapped Ion Mobility Spectrometry)+PASEF®(平行累积连续碎裂,Parallel Accumulation Serial Fragmentation)数据采集模式的dia-PASEF®技术应运而生,并于2020年11月在Nat Methods上发表了题为“diaPASEF: parallel accumulation–serial fragmentation combined with data-independent acquisition“文章。
03 dia-PASEF技术原理
图一. 捕集型离子淌度质谱原理示意图
图二. dia-PASEF技术原理示意图
将dia-PASEF®技术与传统DIA和DDA技术比较,分别使用三种方法检测等量的样本,结果表明,dia-PASEF®技术通过超快的扫描速度,肽段在相同时间内被多次碎裂,使得dia-PASEF®产生的碎片离子峰强度远高于其它两种采集模式(图3a)。对比母离子离子流图进一步表明了dia-PASEF®技术能够有效地提高离子利用率,提升仪器的灵敏度(图3b和3c)。
图三. 不同数据采集模式离子利用率
04 dia-PASEF技术优势
图四. 不同上样量Hela蛋白质鉴定
当dia-PASEF®技术应用于高通量蛋白质组学时,依托4D平台超快扫描速度,短梯度下同样能够实现无与伦比的蛋白鉴定深度和数据完整度。布鲁克与Evosep公司合作,联合推出用于高通量蛋白质组学研究的整体解决方案。当使用5.6min梯度的Evosep色谱方法时,对应一天可以分析200例样本, 200ng Hela样本(200 SPD)蛋白平均鉴定量可以达到5420。同时,分析不同通量下的CV值,即使是在200 SPD的实验条件下,鉴定结果的平均CV值也低于8%,表明在高通量蛋白质组学分析中,dia-PASEF®技术依然可以保证定量的准确性和数据的完整度。上述结果表明, timsTOF Pro使用 dia-PASEF®采集模式能够在短梯度下实现更深度的蛋白覆盖,并且数据重复性好,使其非常适合大队列样本分析(图 5)。
图五. 不同梯度下Hela蛋白质鉴定
图六. timsTOF HT+dia-PASEF采集模式分析HYE混合蛋白样本结果
四. 定量准确性高,动态范围宽
对不同比例HYE蛋白混合样本(样品A:65% Human,15% Yeast,20% E.Coli,样品B:20% Human,15% Yeast,65%E.Coli)进行蛋白定量分析,结果显示不同上样量10ng、50ng、100ng下,两组样本中所有蛋白的定量比值与理论比值高度一致(图7A),且定量蛋白的动态范围达到5个数量级(图7B)。
图七. timsTOF HT+dia-PASEF采集模式蛋白定量准确性分析
双TIMS的协同工作结合PASEF®技术,使得dia-PASEF®实现了几乎100%的离子利用率,提升了检测灵敏度,使其非常适合微量样本分析;
在不牺牲隔离窗口循环时间的同时,淌度分离可有效降低谱图复杂度和提升鉴定可靠性;
仪器稳定性和超快扫描速度可以保证短梯度下的蛋白深度覆盖和数据重复性,使得dia-PASEF®更适合大队列样本分析。
相信dia-PASEF®技术凭借着独特的优势,将大大加快组学研究向临床应用转化,使其能够更好服务于精准医疗相关研究。
参考文献
1.Meier F, et al. diaPASEF: parallel accumulation–serial fragmentation combined with data-independent acquisition[J]. Nature Methods, 2020, 17(12):1229-1236.
2.Christina L , et al. Data-independent acquisition-based SWATH-MS for quantitative proteomics: a tutorial[J]. Molecular Systems Biology, 2018, 14(8):e8126.
3. Romano H, et al. Speeding up label-free quantitation of complex proteome samples using dia-PASEF, 1803363-lcms-201-dia-pasef-lfq-ebook
4.Vadim Demichev, et al. dia-PASEF data analysis using FragPipe and DIA-NN for deep proteomics of low sample amounts[J]. Nature Communications, 2022,13:3944