“蛋白样品冻干过程”干货分享！——深度解析相分离现象及影响因素

冻干可以通过去除样品中的水分，限制分子的流动性，减慢药物成分的物理/化学反应来延长产品的保质期，然而固体状态的配方也不是一直稳定的，由于在干燥过程中，蛋白质暴露在许多应力作用下，在长期的储存过程中，仍然容易发生物理/化学反应。



在冻干及储存过程中，我们常常会加入一些稳定剂来保护蛋白免受应力的影响，主要有两种稳定机理来解释：水替代假说和玻璃化假说；但是两种稳定机制都需要将蛋白质分子分散在稳定剂中，使得蛋白质和稳定剂都处于相同的单一无定形相，即不发生相分离。
那么相分离是如何发生的？为什么会发生？

相分离主要发生在冻干的预冻步骤，在一定程度上取决于冻干的工艺和配方成分。

1、相分离的机理

                                                         图1：冻干分为三个步骤

冻干主要分为三个步骤：预冻，主干燥及次级干燥。（如图1所示）
在预冻过程中，溶液被降到一个很低的温度，晶核形成并且生长，样品中的溶质浓度不断浓缩，可以达到初始浓度的约50倍，如果在热力学和动力学上均利于反应发生的条件下，高浓度的溶质可以导致相分离。

2、相分离热力学
当溶液为成分A 和成分B的混合物，会发生下面的相互作用（如图2所示）。熵和焓之间的竞争决定了相分离的过程。相分离的热力学基于混合物的自由能（弗洛里-哈金斯理论），聚合物由于尺寸大小和连通性，不能充分利用可用体积，大分子量聚合物的熵变化较小，因此，混合物热力学更容易受到较大焓贡献的支配，当ΔGmix > 0: 热力学上有利于相分离 (A-A和B-B相互作用优于A-B相互作用)。


                                                  图2：溶液A和B发生的相互作用

如果相分离是热力学自发以及动力学上利于反应（足够的移动性和时间），蛋白和稳定剂会分离成两个不同的相，富含稳定剂的无定形相以及富含蛋白的无定形相，后者由于缺乏稳定剂的保护，蛋白更易于降解。（如图3所示）


图3：蛋白和稳定剂会分离成两个不同的相

3、相分离的检测方法
无定形-无定形物质的相分离不容易检测，由于检测方法有限，证据不足，目前主要有如下检测方法：

4、工艺参数对相分离的影响

过冷度-----成核温度
❖热力学冻结温度和首次成核温度之间的差值为过冷度；（如图4所示）
❖较高的成核温度会更易导致相分离；（由于溶质在远高于Tg’温度下进行浓缩）


                                                                          图4：过冷度

冷却速度
❖控制达到给定过冷度的速度；
❖缓慢的冻结速度会更容易导致相分离；

退火
❖主要用于填充剂结晶，控制冰晶形态或增加冰晶体的大小，缩短一次干燥时间；
❖如果两相热力学更稳定，退火时间和迁移率的增加可能会提供相分离的机会；

灌装体积
❖较大的灌装体积会对相分离有较大的影响，因为在样品中具有较大的热梯度。

案例分享
成核温度和冷却速度对相分离的影响
对已知的相分离聚合物体系 1:1 PVP29K:DEX10K(100 mg/ml) 进行研究，将冷却台放在拉曼显微镜下进行观察。（如图5所示）

                                                     图5：已知相分离聚合物体系在拉曼显微镜下的观察

成核温度对相分离的影响

                                                                                 图6：成核温度对相分离的影响

与每个单一组分相比，成核温度较高的一组（-5℃）对相分离具有较大的影响；其余的成核温度对相分离影响较小。（如图6所示）

冷却速度对相分离的影响

                                                                                 图7：冷却速度对相分离的影响

所有的冷却速度均会在一定程度上提高相分离的倾向，但是影响较小。（如图7所示）

最终结论
在没有热历史的情况下，成核温度和冷却速率对相分离的影响较小。
成核温度和灌装体积对相分离的影响

                                                               图8：成核温度和灌装体积对相分离的影响

较大的灌装体积（1ml VS 0.2ml）和较高的成核温度（-5℃ VS -10 ℃）会导致相分离,可能是由于样品内部存在较大的温度梯度。（如图8所示）

5、配方成分对相分离的影响
在冻干过程中配方成分的兼容性是阻止相分离的关键，如研究表明聚合物体系的不混溶性随着聚合物分子量的增加而增加。对于蛋白而言，相分离的倾向性可能与稳定剂大小，静电相互作用（盐类），稳定剂类型（填充剂、表面活性剂），稳定剂浓度，蛋白质特性（等电点，大小），配方PH值等有关。

案例分享——配方组分对相分离的影响

❖实验进行了系统的研究，探索蛋白质:糖的比例以及蛋白质(分子量，电荷)和糖(分子量，单糖亚基和长度)的特性如何影响配方在冻干过程中的混溶性。（如图9,10,11所示）

❖蛋白质和糖(200mg /mL)的混合物按以下比例(w:w)：蛋白质：糖——
0:1,1:9,1:4,1:2.3,1:1.5,1:1,1:5:1,2.3:1,4:1,9:1

❖多个Tg’的存在表明存在相分离。


                                                                        图9


                                                                        图10


                                                                         图11

实验表明
●  在所有的蛋白-糖体系均观察到了相分离现象（两个不同的Tg’），尽管不同的比例出现相分离的时间不同；

●  不同蛋白-糖混合物Tg’的宽度不同，有可能多个Tg’会重叠在一起，形成一个较宽的Tg’, 导致无法检测到相分离现象；

●  其中在牛血清蛋白和海藻糖混合物中，当二者比例为1:1.5和1:1 时，观察到存在相分离现象；（如图12所示）


                                                                          图12

● 对于蛋白-糖体系中，二者比例从1:2.3 到4:1 均观察到存在相分离现象；（如图13所示）


                                                                     图13

结论
●   对于几乎所有被研究的体系中，当配方中蛋白质和糖的比例为1:1和1.5:1时确定会发生相分离现象，这表明蛋白质和糖的比例和系统的相分离倾向之间可能存在相关性；

●   在系统的相分离趋势和以下属性之间似乎没有明显的相关性:
     # 蛋白质电荷/等电点
     # 蛋白质分子量
     # 糖的分子量
     # 单糖亚基；

●   在几乎所有研究的配方中，当蛋白和糖的比例为1:1时会发生相分离；

●   本研究结果表明，冻干蛋白配方中应加入过量的稳定剂。

6、冻干蛋白配方中相分离的重要性
●   相分离取决于具体的操作过程和组分；

●   在预冻过程中，温度/时间和浓度是关键因素，会影响系统相分离的趋势；

●   蛋白和稳定剂的物理化学特性会影响相分离；

●   在冻干过程中保护不足会导致长期储藏过程中不稳定性的增加；

●   当缺乏稳定剂时，蛋白在干燥过程中会发生改变（即形成反应型结构），这可能会导致储存过程中潜在的稳定性问题；

●   需要了解相分离如何影响冻干制剂的保质期；

●   相分离检测是稳定性欠佳的指标；

●   未检测到的相分离会影响蛋白质稳定性和整体产品质量；

●   需要更好的检测方法!当前的方法可以证明样品存在相分离，但不能证明样品不存在相分离。

参考文献
[1] Padilla,A.M.et.Al.(2011).”The Study of Phase Separation in a Model Polymer Phase Separating System Using Raman Microscopy and a Low-Temperature Stage: Effect of Cooling Rate and