ACS Nano/ACS Catalysis: 基于AFM-SECM单病毒颗粒检测与酶促反应活性的研究

病毒颗粒的研究一直是纳米科学的热点，病毒颗粒的组装机理、病毒的生理活动可以通过纳米手段进行表征。类病毒颗粒在载药、催化、生物检测等方面的重要应用同样需要纳米手段进行分析。常规的TEM、SEM以及AFM方法通常只给出病毒颗粒的形貌信息，对其成分信息、化学活性信息等难以进行定量的分析。法国国家农业、食品与环境研究所Thierry Michon研究组通过特制的扫描电化学探针将扫描电化学技术(SECM)与AFM技术结合，对单个病毒颗粒进行电化学分析。进一步，Thierry Michon研究组使用AFM-SCEM技术对构建的病毒颗粒催化体系进行了化学活性分析。展示了AFM-SECM在单个病毒颗粒的检测，催化反应研究中的重要作用。相关工作”Electrochemical Atomic Force Microscopy Imaging of Redox-Immunomarked Proteins on Native Potyviruses: From Subparticle to Single-Protein Resolution”于2015年4月23日发表在”ACS Nano”杂志(DOI: 10.1021/acsnano.5b00952)，” Probing the Enzymatic Activity of Individual Biocatalytic fd-Viral Particles by Electrochemical-Atomic Force Microscopy”于2020年6月15日发表于”ACS Catalysis”杂志(DOI: 10.1021/acscatal.0c01920 )。

构建基于抗体的病毒-二茂铁复合物

研究人员选取了莴苣花叶病毒(LMV)作为模型病毒颗粒。这样的病毒近似为直径约10 nm长度约800 nm的圆柱体。LMV的外壳具有两种典型的蛋白组成。外壳蛋白(CP)包裹在核酸外部，是整个圆柱体侧壁外壳部分的组成单元。另一种蛋白为基因链接蛋白(VPg)，这一蛋白可以特异的和病毒RNA的5‘端相连，因此可以作为病毒取向性的标签。将LMV沉积在金衬底上之后，用PEG与BSA封闭。随后用CP或者VPg的兔源IgG抗体作为一抗标记LMV。随后使用偶联有二茂铁(Fc)的抗兔IgG抗体作为二抗标记LMV。此时，对应的CP或VPg区域会被二茂铁标记。

病毒颗粒CP蛋白的电化学检测

特制的电化学探针只有尖端拥有导电特性，而其他部分是绝缘的。使得该探针可以特异性的测量针尖尖端局域的电化学电流信号。探针接触到二茂铁富集的区域时，电子从二茂铁转移到探针上上，将二价铁氧化为三价铁，并形成电化学电流。电子从金衬底上补充至二茂铁结构，将三价铁还原为二价铁，从而形成持续的电化学电流。使用AFM-SECM对CP抗体标记的LMV进行电化学测试。图2a、b显示，只有在LMV出现的区域才会出现电化学电流信号，且该电流信号的电流-电势曲线很好的符合二茂铁的电化学特征。在衬底的区域，没有显著的电化学电流信号。图3显示，电化学电流显示出了簇状分布的特征，这和抗体分布的不均一性有关。

单个病毒颗粒VPg蛋白的电化学检测

使用VPg抗体对LMV进行标记后可以通过电化学电流测量到病毒RNA的5‘端的位置。图4a~d展示了两个单独的LMV颗粒的形貌与电化学电流细节。只在LMV的一侧会有显著的电化学电流信号，为预期RNA的5‘端一侧。进一步，电化学电流信号会沿着LMV的端点外延约十几纳米。这也与二抗标记形成的二茂铁团簇对应。进一步证实了所观察的结构为预期的电化学信号。

二茂铁-葡萄糖脱氢酶-fd噬菌体复合物的构建与纳米电化学检测原理

图5a展示了二茂铁-葡萄糖脱氢酶-fd噬菌体复合物的构建过程。首先将fd噬菌体沉积在SiO₂衬底上，随后用PEG和BSA封闭。使用兔源fd噬菌体抗体标记噬菌体，随后使用连接有葡萄糖脱氢酶(GDH)的抗兔抗体进行标记。使用兔源GDH抗体进行标记后，使用偶联有二茂铁的抗兔抗体进行标记，最终形成二茂铁-葡萄糖脱氢酶-fd噬菌体复合物。在扫描电化学探针接触复合物时，若体系中存在葡萄糖，二茂铁向探针传递电子并氧化为三价铁。高活性的三价铁会诱导GDH氧化葡萄糖，产生的电子将二茂铁还原为二价铁。由于衬底并不导电，体系中足量的葡萄糖可以不断被消耗从而形成稳定的电化学电流。图5b展示了只有再加入葡萄糖之后，仅在复合物存在的地方出现电化学电流。

酶促反应的空间分布与底物依赖性

图6展示了酶促反应复合物的电化学电流辐射状分布的特点，即越靠近噬菌体中央，电化学电流信号越强。这与复合物中长程的电子传递链有关。探针接触复合物后，形成的三价二茂铁会从近邻的二茂铁获得电子，产生长距离电子传递链，最终在较远出通过葡萄糖氧化获取电子。基于这样的理论，靠近噬菌体中部的位置会有最强的电化学电流信号。建模模拟证实了这一理论。

图7研究了酶促反应复合物与底物浓度的相关性。随着葡萄糖浓度的升高，电化学电流呈现出先升高后下降的趋势。电化学电流的信号反应了酶催化速率的变化，酶催化反应越快，电化学电流越大。体系选用的葡萄糖脱氢酶具有可逆的底物抑制性，即在较高浓度的葡萄糖下反而会抑制酶催化反应，电化学信号对此也有很好的体现。

该工作基于在Bruker NanoWizard®平台上搭建的扫描电化学体系，研究人员自行制备了扫描电化学探针，建立起四电极法的电化学测试方法。 现在Bruker在NanoWizard® 4 XP BioAFM平台上推出了商业化的扫描电化学解决方案，包括Bruker的扫描电化学探针与四电极法的测试体系，为生命科学、化学、材料科学等领域的纳米扫描电化学研究提供一站式解决方案。

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https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.5b00952

https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acscatal.0c01920

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