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利用酶标仪进行细胞增殖与活力测定
利用酶标仪进行细胞增殖与活力测定
酶标仪在细胞生物学与 药物筛选方面有着非常高的使用频率 而在各种细胞检测实验中 细胞增殖能力的检测是 最为常见也是最基础的检测之一 ●为什么要检测细胞状态呢？ 细胞状态是直接反应细胞生理状态的重要指标，通过监测细胞在各种化合物刺激作用下的反应状态，从而确定测试分子是否对细胞增殖有影响或具有直接的细胞毒性效应。 ● 有哪些方法能检测细胞增殖能力？ 检测细胞增殖的方法很多，目前可用直接法和间接法来测定。其中直接法，是通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。例如：Ki67细胞增殖检测；BrdU细胞增殖检测；EdU细胞增殖检测。而间接法，即细胞活力检测方法，则是通过检测样品中健康细胞数目来评价细胞的增殖能力。例如：MTT法、CCK8法等。细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据还是直接法的测试结果。 BrdU细胞增殖检测 Law 用 BrdU 预处理的细胞中， BrdU 可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的 DNA 双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA 中 BrdU 的含量（如采用鼠抗 BrdU 单克隆抗体特异识别 BrdU, 再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG 二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。若采用ELISA法进行检测，往往在450nm处进行检测。 经典实验—MTT法 Law MTT（四氮唑蓝）是一种适合于高通量筛选96孔的细胞活力测定法。它是利用活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶对MTT进行还原，形成不溶于水的紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，最后使用特定的有机溶剂，如二甲基亚砜（DMSO）等溶解后，在570nm处检测。MTT法实际上是检测细胞线粒体的代谢活力。 优点： 步骤少 耗材少 无放射性 缺点： 不适合于悬浮细胞 细胞毒性大 培养板中沉淀的细胞碎片易造成读数干扰 CCK-8法 Law CCK-8是由MTT衍生出来的一种方法，它可以被线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。通过酶标仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。 优点： 操作简单快速 无辐射 可检测活力和毒性 适合悬浮细胞 甲瓒可溶于水 缺点： 比MTT贵 试剂颜色与细胞培养基颜色相近 易漏加 SRB比色法 Law SRB（Sulforhodamine B）是一种粉红色阴离子染料，易溶于水，在酸性条件下可特异性地与细胞内组成蛋白质的碱性氨基酸结合；在540 nm波长下产生吸收峰，吸光值与细胞量成线性正相关，故可用作细胞数的定量检测。 优点： 细胞固定 不易受化合物干扰 不易变色稳定性好 缺点： 操作步骤复杂 间接法比较 MTT CCK-8 SRB 溶解度 不溶 水溶 不溶 检测波长 570nm 450nm 540nm 特点 结晶 液体 液体 是否需要溶解 需DMSO溶解 不需要 需要Trisbase 方便度 ＋＋ ＋＋＋ ＋ 重复性 ＋ ＋＋＋ ＋＋ 稳定性 ＋ ＋＋ ＋＋＋ ● 提示 细胞活性与增殖实验作为最常见的细胞实验之一，市面上已有很多成熟而稳定的试剂厂家，但不同厂家的试剂配方略有差异，因而在检测方式上也会有略微区别，客户需根据不同厂家的操作步骤进行试验的优化。
