磁珠法提核酸

磁珠法纯化DNA主要是利用利息交换吸附材料吸附核酸，从而将核酸和蛋白质等其细胞中其他物质分离。本文主要概述了核酸分离与纯化的原则、核酸分离与纯化的步骤、磁珠法纯化DNA原理。核酸分离与纯化的原则 核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。 在分离核酸时应遵循以下原则：保证核酸分子一级结构的完整性；排除其他分子污染。核酸分离与纯化的步骤 大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。 1. 细胞裂解：核酸必须从细胞或其他生物物质中释放出来。细胞裂解可通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。  

 (1) 机械作用:包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。这些方法用机械力使细胞破碎,但机械力也可引起核酸链的断裂,因而不适用于高分子量长链核酸的分离。 (2) 化学作用：在一定pH环境和变性条件下，细胞破裂，蛋白质变性沉淀，核酸被释放到水相。上述变性条件可通过加热、加入表面活性剂(SDS、Triton X-100 等) 或强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍) 而获得。而pH环境则由加入的强碱（NaOH）或缓冲液 ( TE、STE 等) 提供。在一定的pH环境下,表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋白质和多糖沉淀，缓冲液中的一些金属离子螯合剂（EDTA等）可螯合维持核酸酶活性所必须的金属离子Mg2+ 、Ca2+ ，从而抑制核酸酶的活性，保护核酸不被降解

 (3) 酶作用：主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶（蛋白酶K、植物蛋白酶或链酶蛋白酶）以使细胞破裂，核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的分离。其中溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸残基间的β-(1 ,4) 键水解。蛋白酶K能催化水解多种多肽键,其在65 ℃及有EDTA、尿素(1～4mol/ L) 和去污剂(0. 5 %SDS 或 1 %Triton X-100) 存在时仍保留酶活性,这有利于提高对高分子量核酸的提取效率。在实际工作中,酶作用、机械作用、化学作用经常联合使用。具体选择哪种或哪几种方法可根据细胞类型、待分离的核酸类型及后续实验目的来确定。  

2. 酶处理：在核酸提取过程中,可通过加入适当的酶使不需要的物质降解，以利于核酸的分离与纯化。如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K 或链酶蛋白酶) 可以降解蛋白质,灭活核酸酶（DNase 和RNase），DNase 和RNase 也用于去除不需要的核酸。  

3. 核酸的分离与纯化：核酸的高电荷磷酸骨架使其比蛋白质、多糖、脂肪等其他生物大分子物质更具亲水性,根据它们理化性质的差异,用选择性沉淀、层析、密度梯度离心等方法可将核酸分离、纯化。  

 (1) 酚提取/沉淀法：核酸分离的一个经典方法是酚∶氯仿抽提法。细胞裂解后离心分离含核酸的水相,加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25 ∶24 ∶1 体积) 混合液。依据应用目的,两相经漩涡振荡混匀（适用于分离小分子量核酸）或简单颠倒混匀（适用于分离高分子量核酸）后离心分离。疏水性的蛋白质被分配至有机相，核酸则被留于上层水相。酚是一种有机溶剂，预先要用STE 缓冲液饱和，因未饱和的酚会吸收水相而带走一部分核酸。酚也易氧化发黄,而氧化的酚可引起核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交联：故在制备酚饱和液时要加入82羟基喹咛,以防止酚氧化。氯仿可去除脂肪,使更多蛋白质变性,从而提高提取效率。异戊醇则可减少操作过程中产生的气泡。核酸盐可被一些有机溶剂沉淀,通过沉淀可浓缩核酸,改变核酸溶解缓冲液的种类以及去除某些杂质分子。典型的例子是在酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀,在含核酸的水相中加入pH5. 0～5.5，终浓度为0. 3M 的NaOAc 或KOAc 后,钠离子会中和核酸磷酸骨架上的负电荷,在酸性环境中促进核酸的疏水复性。然后加入2～2.5 倍体积的乙醇，经一定时间的孵育，可使核酸有效地沉淀。其他的一些有机溶剂（异丙醇、聚乙二醇(等）和盐类（10. 0mol/ L 醋酸铵、8. 0mol/ L 的氯化锂、氯化镁和低浓度的氯化锌等）。不同的离子对一些酶有抑制作用或可影响核酸的沉淀和溶解，在实际使用时应予以选择。经离心收集，核酸沉淀用70 %的乙醇漂洗以除去多余的盐分，即可获得纯化的核酸。

 (2) 层析法：层析法是利用不同物质某些理化性质的差异而建立的分离分析方法。包括吸附层析、亲和层析、离子交换层析等方法在内的层析法。因分离和纯化同步进行,并且有商品试剂盒供应，而被广泛应用于核酸的纯化。在一定的离子环境下,核酸可被选择性地吸附到硅土、硅胶或玻璃表面而与其他生物分子分离。另外一些选择性吸附方法以经修饰或包被的磁珠作为固相载体,磁珠可通过磁场分离而无需离心,结合至固相载体的核酸可用低盐缓冲液或水洗脱。该法分离纯化核酸,具有质量好、产量高、成本低、快速、简便、节省人力以及易于实现自动化等优点。

 (3) 吸附法：玻璃粉或玻璃珠被证实为一种有效的核酸吸附剂。在高盐溶液中,核酸可被吸附至玻璃基质上,离液盐碘化钠或高氯酸钠可促进DNA 与玻璃基质的结合。在该方法中,细胞在碱性环境下裂解,裂解液用醋酸钾缓冲液中和后,直接加至含异丙醇的玻璃珠滤板,被异丙醇沉淀的质粒DNA 结合至玻璃珠,用80 %乙醇真空抽洗除去细胞残片和蛋白质沉淀。最后用含RNase的TE缓冲液洗脱与玻璃珠结合的DNA，获得的DNA可直接用于测序。

磁珠法纯化DNA原理

 磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。

 硅磁(Magnetic Silica Particle)就是指磁珠微珠表面包裹一层硅材料，来吸附核酸，其纯化原理类型于玻璃奶的纯化方式。

 离心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一层可发生离心交换的材料(如DEAE，COOH)等，从而达到吸附核酸目的。不同性质的磁珠微珠所对应的纯化原理是不一致。使用磁珠法来纯化核酸的最大优点就是自动化。磁珠在磁场条件下可以发生聚集或分散，从而可彻底摆脱离心等所需的手工操作流程。

 使用羧化磁珠同样可以分离纯化质粒DNA。该法在细胞裂解后，离心分离含质粒的水相，再加入羧化的磁粒，然后用 PEG/ NaCl 沉淀，使目的DNA 吸附至磁珠，,最后磁场分离被吸附的DNA，经乙醇洗涤，用TE洗脱，可获得高产量的适用于毛细管测序的模板DNA。

磁珠法纯化DNA原理

 磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。

 硅磁(Magnetic Silica Particle)就是指磁珠微珠表面包裹一层硅材料，来吸附核酸，其纯化原理类型于玻璃奶的纯化方式。

 离心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一层可发生离心交换的材料(如DEAE，COOH)等，从而达到吸附核酸目的。不同性质的磁珠微珠所对应的纯化原理是不一致。使用磁珠法来纯化核酸的最大优点就是自动化。磁珠在磁场条件下可以发生聚集或分散，从而可彻底摆脱离心等所需的手工操作流程。

 使用羧化磁珠同样可以分离纯化质粒DNA。该法在细胞裂解后，离心分离含质粒的水相，再加入羧化的磁粒，然后用 PEG/ NaCl 沉淀，使目的DNA 吸附至磁珠，,最后磁场分离被吸附的DNA，经乙醇洗涤，用TE洗脱，可获得高产量的适用于毛细管测序的模板DNA。

Auto-Pure20核酸提取纯化系统

Auto-Pure20核酸提取纯化仪是通过使用磁珠法试剂提取纯化核酸的设备，具有自动化程度高，提取速度快，结果稳定，操作简便等优点。可同时纯化1-20个样品，搭配不同种类的磁珠核酸试剂，可以快速提取动植物组织、血液、体液、刑事检体等样品中的DNA和RNA。广泛应用于科研、疾控系统、食品安全、法医、临床监测等领域。

产品特点

显示及控制软件
-大屏幕显示；触屏式操作，简单易用
-无需外接电脑；单机即可操作，节省空间
-将配置APP软件，可通过安卓平板电脑，实时监控系统
温度控制
-用户可根据要求自定义裂解、洗脱温度
编程功能
-强大的程序编辑功能；可满足不同试剂要求

-可扩展以太网远程控制
快速提取及高纯度、高得率、重复性好
-操作时间短，15~40min/次。每次可同时提取1~20份样品
-根据试剂优化提纯方案，提取的DNA/RNA纯度高，实现了更高的提取效率
-避免人工操作引起的差异及错误，结果稳定，重复性好
-选择优质耗材和工艺，磁珠损耗低，回收率高
污染控制及消毒功能
-具有紫外消毒功能，减低不同批次间样品的污染
试剂开放
-开放系统, 可适用各种磁珠法提取试剂，并根据不同试剂优化提纯方案，提取的核酸纯度高
安全可靠
-抽屉式进样，防止实验人员受伤
-全自动运行、配备一次性耗材，避免接触有毒物质
-智能化操作，避免有害物质对人体的危害
-采用专利设计的9联提取管，可单独封装，单独上机进行核酸提取纯化，减少试剂浪费，特别适合科研单位使用

操作流程

性能指标

型号Auto-Pure20样品通量1~20样品容量20~1000μl磁珠回收率>95%磁棒数量20提纯灵敏度100拷贝样品的阳性检出率>95%提纯孔间差CV<3%加热范围裂解温度：室温~90℃ / 洗脱温度：室温~90℃操作界面7寸高分辨率彩色触摸屏内部程序内建15组模式程序(可存储>100组程序),用户可根据试剂盒进行设置程序管理新建,编辑,删除模式程序,自由灵活编辑提取程序仪器扩展接口4个标准USB接口，1个B型USB接口，以太网接口，内置SD卡，无线Wifi杀菌消毒紫外消毒排气方式风扇电源AC110~220V，50/60Hz体积440mmx467mmx453mm

注：还有Auto-Pure32可供选择，可同时纯化1-32个样品，使用96孔深孔板试剂盒.