《iScience》重磅丨LESA-MS 单细胞高通量脂质分析聚焦帕金森发病机理

发布时间： 2022-07-08 11:31 来源：华质泰科生物技术（北京）有限公司

亮点 1

流式细胞荧光分选技术（FACS）与液滴萃取表面分析质谱（LESA-MS）结合，建立高通量单细胞脂质分析平台，测量群体中大量单细胞的脂质。

亮点 2

发现人类多巴胺神经元群体内和群体间的脂质差异，和细胞异质性在个体多巴胺神经元功能代谢中的重要性，提示 A53T 突变型 α-突触核蛋白（SNCA）神经元的膜功能受损。

亮点 3

方法学高度标准化和强质控，不需额外的成像分析，直接将非靶向脂质谱应用于单细胞，探索细胞群的功能异质性及对疾病病理学的影响，意义重大，必将在生物医学领域开创广泛应用。

简介

单细胞基因组学和转录组学的研究表明，在组织水平上存在复杂的细胞异质性。欲了解细胞异质性对代谢的影响，需开发一种单细胞脂质分析方法，测量人群中大量单细胞脂质。

英国剑桥大学代谢院核心代谢组学与脂质组学 Albert Koulman 课题组和英国痴呆研究所、剑桥大学临床神经科学系 Emmanouil Metzakopian 课题组利用基于“多通道纳喷源”的“液滴萃取表面分析”（LESA）技术与高分辨质谱（HRMS）联用，成功搭建了高通量非靶向单细胞脂质分析平台，分析通量可达280个单细胞/天。2020年底，《iScience》在线发表了这一突破性重要成果。

图1、本研究的 LESA-HRMS 分析流程

课题组利用三个独立群组的脂质分析验证了该平台的可靠性，并进一步将此平台应用于分析诱导多功能干细胞（iPSCs）发育获得的人类多巴胺神经元细胞，2天内分析560个单细胞，发现 SNCA-A53T 基因突变会损伤神经元细胞膜功能，从而揭示了 SNCA-A53T 基因突变引致帕金森的致病机理。

LESA-HRMS 分析平台突显了细胞异质性在个人多巴胺神经元功能代谢中的重要性，表明 A53Tα-突触核蛋白（SNCA）突变神经元具有受损的膜功能。该单细胞脂质分析平台可以提供可靠的数据，将扩展生物医学研究的前沿领域。

工作流程

第一步

对诱导多功能干细胞基因编辑，使其表达红色荧光蛋白，并进行多巴胺能分化；

第二步

将细胞送入流式细胞仪，通过流式细胞荧光分选技术（FACS）进行单细胞分选；

第三步

分选出的单细胞以 LESA-HRMS 进行脂质组学分析。

LESA-HRMS：

萃取剂：含 20 mM 乙酸铵的异丙醇、甲醇、氯仿混合溶液（体积比4:2:1）

萃取体积：1 μL

萃取时间：7 s

直喷分析时间：90 s

纳喷电压：1.4 kV

质谱型号：Exactive Orbitrap

质谱采集模式：正离子模式，m/z 650-850 全扫

单细胞脂质分析与细胞总脂分析

图2 （A）细胞总脂 PLS-DA 分析图（C）单细胞脂质 PLS-DA 分析图（绿色表示野生型，蓝色表示突变型）

本研究共使用了4个野生型 SNCA 样本（绿色）和4个 SNCA-A53T 突变样本（蓝色），每个样本各取70个单细胞进行分析，去除 PC 34:1 和 PC 36:2 两种脂质同时缺失的细胞（可能是细胞未成功进入流式细胞仪造成，详见参考文献），剩余细胞进行统计学分析。

图2（C）中每个点表示一个单细胞，图2（A）中每个点表示样本中约70个单细胞的平均值。偏最小二乘回归分析图（PLS-DA 图）显示，当样本进行总脂分析时，通过细胞脂质差异能够显著的区分野生型和突变样本；而当进行单细胞分析时，虽然两种基因型样本仍有一定的区分度，但由于细胞异质性较大，因而分布很广。

另外，不同基因型脂质间差异主要是甘油磷酸胆碱 PC 36:2 造成的。虽然作为细胞总体进行统计分析时，野生型和突变型的 PC 36:2 含量具有显著性差异，但由于细胞异质性很强，组间差异变小。

因此，搭建一个能够获取细胞异质性和细胞特异性特征的高通量单细胞分析平台是十分必要的。在这个平台的开发过程中，课题组尽可能多地自动化流程，以最大限度地增加在给定时间内可分析的样本数量，并使分析标准化，以减少误差来源。流程的标准化消除了细胞储存效应，结果也表明样品储存不会对细胞的脂质组成产生任何偏差。还发现 LESA 液滴萃取暨纳喷注射顺序和脂质组成之间没有关系（参见原文图S1），这表明从第一个和最后一个单细胞样本生成的数据是可比较的。

因为 LESA 需要的溶剂体积比传统提取方法小得多（1-3微升），从而产生更高浓度的提取物。当然基于 LESA-MS 的方法进行单细胞脂质分析时，细胞定位是重大挑战。尽管其他方法借用成像定位细胞（Ellis 等人，2012；Neumann 等人，2019），但这那很冗繁耗时和降低效率。课题组通过校正流式细胞分选，可最大限度地提高细胞被分配到孔中央的几率，随后在该点进行 LESA 萃取；在某些情况下，LESA 会遗漏某个细胞。通过搜索两种冗余（最丰富）脂质（PC 34:1 和 PC 36:2）产生的质谱信号来确定这些遗漏，若两种脂质都不在，则该样品被视为失败，并从随后的统计分析中剔除。识别和排除两个细胞错误地分配到同一个孔中也很重要，可通过寻找具有明显更高丰度的总脂质的样品来实现这一点（两个细胞的脂质相对于单个细胞的脂质丰度要高）。

基于 LESA-MS 的单细胞脂质分析方法灵敏度已然很高。可以想象在这一方法的检测下限（LLOD）以下，仍有大量的超痕量的脂质。理论上，方法灵敏度的小幅度提高应可大幅增加测得的脂质数量。目前该领域仍然存在着局限性，未来随着质谱仪灵敏度的快速提升和改进，此 LESA-MS 平台将能扩展检测到更多的单细胞内超低丰度脂质。

SNCA-A53T 多巴胺神经元的膜功能受损

已有研究表明 SNCA 可能在脂质运输和突触膜生物合成中起到关键作用，因此，SNCA-A53T 突变可能导致细胞膜组成变化，从而破坏突触的传递作用。课题组根据 PC 36:2的丰度高低，将11种脂质（包括 PC 36:2）各分为两组，发现其中4种在两种基因型的表达中有显著差异，可能操控细胞脂质组成。细胞膜中总 PC 和总 PE 比值影响双分子层流动性、囊泡形成和跨膜蛋白的组成和存在。研究发现 SNCA-A53T 神经元细胞中 PC 36:2高低丰度组间的 PC:PE 比值差异比野生型中更大。大部分突变组 PC 36:2 较低，导致 PC:PE 值较低。

健康细胞通常有一系列机制来应对生理刺激，并适应这种压力。课题组看到野生型（本文指健康细胞）的异质性更强，鉴于细胞膜是细胞脂质最大的来源，可能是这种细胞膜组成的异质性使细胞更好地做出反应机制，而突变型（本文指致病型）脂质的分布更狭窄，使它们损失了应激能力。

总而言之，本研究介绍的 LESA-HRMS 单细胞质谱分析方法为探索突变如何操控脂质代谢提供了解决方案。

● 参考文献

Snowden et al., Development and Application of High-Throughput Single Cell Lipid Profiling: A Study of SNCA-A53T Human Dopamine Neurons. Cell Press: iScience 23, 101703, November 20, 2020

https://doi.org/10.1016/j.isci.2020.101703

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关于液滴萃取表面分析 LESA

LESA 多通道纳喷离子源利用机器人抓取、转移和连接样品与刻蚀于芯片上的400个高度重现的独立喷针，进行全自动的纳升电喷雾质谱分析，实现其他纳喷质谱或常规液质不能实现的功能：

（1）纳升级注射全自动电喷雾直接进样，无需清洗，自动分析达400个样品；零残留、高灵敏度。适于活性物质或代谢物及毒性成分的鉴定解析；对组学分析、ADCs 抗体药物偶联物、非共作用研究特效。

（2）馏分收集，以信号累加方式鉴定复杂基质中的痕量未知物。

（3）在线 nanoLC-MS 接口，可自动感应喷雾电流和堵塞，3秒自动移换喷头，实现无人值守的连续分析，保障超长时间 nanoLC-MS 分析的连贯性、重复性。

（4）表面轮廓分析，以一滴溶剂在中药切片、生物体组织、培养皿、药材、薄层板、MALDI 板等特定表面进行1秒的微萃取，纳升电喷雾质谱检测，实现分子成像和或分布轮廓分析（0.4毫米空间分辨率）。

（5）可升级为 LESA Plus，液滴萃取后，通过六通阀切换萃取液至纳升或微升柱，分离后再纳喷质谱检测。LESA兼容主流质谱厂商（Agilent、SCIEX、ThermoFisher、Waters、Bruker、Shimadzu）各类型质谱仪如 FTMS、Orbi、飞行时间、离子阱、三重四极杆及混联质谱。

文章来源：华质泰科服务平台微信公众号

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原位质谱；质谱成像