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中科院大化所基于纳喷机器人原位质谱法的非靶代谢组学新发现
国科大大连化物所许国旺研究员团队利用全自动纳升电喷雾直接进样质谱技术开发代谢组学分析新方法，近期连续于分析科学顶级期刊《Anal Chem》发布三篇重磅成果。
基于纳升电喷雾直接进样的高分辨质谱（nanoESI DI-HRMS），结合质谱信息非依赖采集（DIA）、拼接式质谱采集（又称 “谱图缝合采集”）、毛细管微探针取样等技术，实现了大规模人群样本代谢组的高通量分析和少至20个哺乳动物细胞脂质组的高敏高通量检测。
01
Strategy for Nontargeted Metabolomic Annotation and Quantitation Using a High-Resolution Spectral-Stitching Nanoelectrospray Direct-Infusion Mass Spectrometry with Data- Independent Acquisition
基于数据非依赖采集的高分辨质谱缝合技术结合纳喷直接进样质谱法实现非靶代谢组学定性和定量
色谱-质谱联用是目前代谢组学分析的主流方法，但是色谱分离的慢速度限制了其在大规模样本分析中的应用。直接进样质谱法（DI-MS）已成为除此之外的另一种选择，可实现同时对生物基质中成百上千代谢产物的全息分析。然而，电喷雾离子化本身的特点却依然会使得直接喷雾质谱法面临离子抑制导致代谢物检测灵敏度下降、缺少色谱分离或使定性定量面临挑战等瓶颈。
针对上述难题，研究团队提出了一种基于数据非依赖采集（DIA）模式的纳升电喷雾直接进样高分辨质谱（nanoESI DI-HRMS）策略，可对生物基质中的非靶向代谢组学数据进行准确定性和定量。策略包括匹配代谢产物与代谢前体的同位素分布模式、二级谱相似性、母离子和子离子强度相关性等。
图1、使用基于芯片的 Triversa NanoMate 纳升电喷雾离子化装置和质谱仪联用进行 nanoESI DI-HRMS 分析。
分别用含有40个和79个代谢产物的两组混标溶液来建立代谢产物定性策略，验证其可靠性。标液的总定性百分比为100%，血清加标的总定性百分比为94.9%。代谢物的定量通过母离子或特征离子的丰度比来实现。
通过对糖尿病患者的血清代谢谱分析应用，结果表明，该策略尤其适于大队列样本的高通量代谢组学研究。
● 参考文献：
Lichao Wang, Wangjie Lv, Xiaoshan Sun, Fujian Zheng, Tianrun Xu, Xinyu Liu, Hang Li, Xin Lu, Xiaojun Peng, Chunxiu Hu, and Guowang Xu. Strategy for Nontargeted Metabolomic Annotation and Quantitation Using a High-Resolution Spectral-Stitching Nanoelectrospray Direct-Infusion Mass Spectrometry with Data- Independent Acquisition. Anal. Chem. 2021, 93, 10528-10537
https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c01480
02
Lipid Profiling of 20 Mammalian Cells by Capillary Microsampling Combined with High-Resolution Spectral Stitching Nanoelectrospray Ionization Direct-Infusion Mass Spectrometry
毛细管微探针取样与纳升电喷雾直接进样高分辨质谱分析20个哺乳动物细胞中的脂质
对细胞代谢的研究有助于深入了解其潜在的分子机制和代谢功能。迄今为止，大多数基于色谱-质谱的细胞代谢研究都需要群体细胞（数百万）来获得信息丰富的代谢组。然而这些方法不仅耗时，还不适用于循环肿瘤细胞、干细胞和神经元等数量有限的细胞样本。因此，开发一种高通量、高灵敏度地分析数十个细胞代谢组的方法至关重要。
本研究提出了一种新的基于高分辨质谱-纳升电喷雾直接进样（HRSS-nanoESI DI-MS）的脂质组学分析方法，结合毛细管微探针采样，快速、高敏地检测20个哺乳动物细胞中的脂质组。
图2、对数十个细胞进行脂质组学分析的工作流程
该平台可通过毛细管微探针快速、准确地收集细胞，用喷雾溶剂直接在96孔板中提取脂质，并在3分钟内检测出涵盖19个脂类亚类的500多种脂质代谢物。该法已成功应用于研究不同肿瘤细胞类型和亚型的脂质特征以及不同组织样本中的靶细胞分类，在生命科学和临床医学研究中展现巨大潜力。
毛细管微探针采样
全自动 nanoESI 纳升电喷雾离子源
基于芯片的纳升电喷雾装置（TriVersa NanoMate，芯片多通道纳喷离子源）对20个细胞的脂质提取物直接分析。设备含400个内径为4.1μm 喷嘴的芯片，96孔板；进样量：5 μL、喷雾电压：1.5 kV（正离子）或1.8 kV（负离子）
质谱分析
离子通道毛细管温度：275℃
分辨率：240,000（全扫描）或120,000（PRM 模式）
AGC：10^6（全扫描）或5x10^5（PRM模式）
拼接式质谱采集，设置连续的较窄的扫描窗口，以解决离子竞争问题，覆盖更多低丰度脂质，提高检测灵敏度。
癌细胞的分类
采用 HRSS-nanoESI DI-MS 方法分析来自三种不同癌细胞类型（MCF7、MHCC97H 和 VCaP）的20个细胞的脂质，结果呈现明显的聚类和分离。
图3、A：三种不同类型肿瘤细胞的主成分（PCA）分析。B：用于鉴别肿瘤细胞类型的96个具有显著统计学差异（p<0.05）的脂质的热图。
癌细胞亚型的分类
研究了三种乳腺癌细胞亚型（MCF7、HCC1937 和 MDA-MB-231）和相对应的正常细胞系（MCF10A），可从质谱图观察到不同癌细胞亚型在单细胞水平上的脂质分布的视觉异质性。PCA 聚类分析极易将这些细胞分为4组。热图分析表明共有77个组间存在显著差异的脂质特征离子。研究结果证明，针对数量有限的细胞样本，该方法能鉴别细胞亚型中细微的脂质组差异。
图4、三种不同乳腺癌细胞亚型及其对应的正常细胞株的 PCA 分析和热图分析。
不同组织样本中靶细胞的区分
为评估该方法在病理学样本分析中的潜力，研究组使用激光捕获显微切割技术（LCM）从结肠癌组织（CCT）和相邻非癌组织（ANT）中准确收集9批次各20个细胞，并通过毛细管微探针取样结合 HRSS-nanoESI DI-MS 方法进行分析。
图5、LCM 获得的结肠癌组织靶细胞（A）和相邻非癌组织靶细胞（B）。
图6、对结肠癌组织（CCT）和相邻非癌组织（ANT）的20个靶细胞进行 PCA 分析，两组的全息脂质组学特征存在显著差异。此结论进一步证明了该方法的临床应用潜力。
该分析方法的卓越性能体现在四个方面：（1）无需依赖大规模细胞培养，仅通过毛细管微探针准确快速地对20个细胞样本采样，使限量细胞样本分析成为可能；（2）抽取的20个细胞直接在96孔板中进行脂质提取，显著减少了常规样品制备造成的微量样本损失；（3）纳升电喷雾直接全自动进样到质谱采集分析，无需耗时的色谱分离，提升了通量和设备效率；（4）nanoESI DI-MS 与 HRSS 的联用有助于提高检测灵敏度。纳升电喷雾显著降低了电喷雾离子源通常自带的离子抑制效应，而质谱拼接采集模式又进一步降低了检测器常发生的离子竞争拥堵，大大提升了检测更多低丰度脂质的可能性。
总之，该方法有望广泛应用于细胞识别和分类、肿瘤细胞耐药性研究、以及单细胞分析等。
● 参考文献：
Tianrun Xu, Hang Li, Disheng Feng, Peng Dou, Xianzhe Shi, Chunxiu Hu, and Guowang Xu. Lipid Profiling of 20 Mammalian Cells by Capillary Microsampling Combined with High-Resolution Spectral Stitching Nanoelectrospray Ionization Direct-Infusion Mass Spectrometry. Anal. Chem. 2021, 93, 10031-10038
https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c00373
03
Novel Stable Isotope-Resolved Metabolomics Method for a Small Number of Cells Using Chip-Based Nanoelectrospray Mass Spectrometry
基于芯片的纳升电喷雾质谱直接进样的稳定同位素示踪代谢组学新方法
稳定同位素示踪代谢组学（SIRM）能够提供特定靶点的代谢物合成、转化和分解的动态过程，是研究肿瘤细胞代谢的有力工具。常用的基于色谱-质谱（LC-MS）联用的 SIRM 分析方法，需要大量的细胞，不适于少量珍稀细胞的分析。
大化所许国旺研究员团队与大连理工大学林晓惠老师团队合作，建立了一种新的基于芯片的纳升电喷雾质谱直接进样的 SIRM 方法，实现少量细胞的稳定同位素标记代谢物的高敏和高通量示踪。
基于芯片的纳升电喷雾直接进样由 TriVersa NanoMate（芯片多通道纳喷离子源）实现。
谷氨酰胺是癌症代谢中重要的碳源。将未标记和13C 标记的细胞放入96孔板中培养和提取，然后直接进样到质谱，以全扫描模式和平行反应监测（PRM）模式分析44个谷氨酰胺衍生代谢物信号及其同位素分布模式。
为确定 PRM 中代谢相关的二级质谱（MS2）片段，团队依据代谢物及其同位素标记形式之间特有的精确质量数偏移和二级谱图相似性，提出了一种基于直接进样质谱的二级离子筛选策略，用于目标代谢物及其同位素标记形式的准确定性定量。策略包括 MS2 精确质量数匹配、假阳性筛选和 MS2 片段分组。在正负离子模式下，分别得到了292对和349对 MS2 离子。通过谱图数据库检索，鉴定出31个具有同位素特征的目标代谢产物，并随即定量，其灵敏度和准确度均优于常规的 MS1 定量法。
该方法仅消耗少量的细胞和稳定同位素标记试剂，分析时间仅2-3分钟，特别适于珍稀细胞的高通量 SIRM 分析。
图7、雷公藤甲素处理的 U251 IDH1RH 细胞株的代谢变化。（A）差异代谢产物热图。（B）代谢产物总量（AreaSum）和13C同位素富集的代谢产物（13C%）。红色字体代表在高浓度雷公藤甲素处理下总量增加，蓝色字体代表降低。（C） 2-氨基己二酸的同位素质量分布。显著性水平：*p <0.05，** p <0.01，和*** p <0.001。
● 参考文献：
Di Yu, Fujian Zheng, Lichao Wang, Chao Li, Xin Lu, Xiaohui Lin, Lina Zhou, and Guowang Xu. Novel Stable Isotope-Resolved Metabolomics Method for a Small Number of Cells Using Chip-Based Nanoelectrospray Mass Spectrometry. Anal. Chem. 2021, 93, 13765-13773
https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c01507
此推文节选编译自 AC 论文原文的摘要和结论部分，错误遗漏之处难免，敬请谅解。
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文章来源：华质泰科生物技术 微信公众号
| 标签： | 原位质谱；快速分析；代谢组学 |
