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AP-MALDI 筛查 SARS-CoV-2 新冠病毒 S 蛋白
COVID-19 肆虐全球已经一年半，国内疫情向好发展之时，国外却不容乐观。一波未平一波又起。近日，印度的新冠肺炎疫情状况着实堪忧，正向周边国家扩散。
导致当前健康危机的 SARS-CoV-2是一种具有高度传染性的包膜 RNA 病毒。包裹病毒粒子的脂肪膜表面有刺突糖蛋白，帮助病毒进入宿主细胞，促进复制病毒的释放，且在传播过程中提供保护，其中最突出的是 S 蛋白。S 蛋白对 SARS-CoV-2具有特异性，在人类宿主中检测到 S 蛋白是 SARS-CoV-2感染的主要证据。
肽质量指纹谱（PMF）是一种利用基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）高通量鉴定蛋白质的技术。简而言之，将感兴趣的蛋白质酶解成具有代表性的肽，通过质谱精确质量测定，在数据库中搜索肽段序列进行蛋白质鉴定。例如 SARS-CoV-2 病毒的 S 蛋白，可通过 MALDI 快速评估诊断肽。
常压 AP-MALDI 进一步扩展了 MALDI-MS。与真空 MALDI 相比，AP-MALDI 进行肽质量指纹图谱的应用，更接近实时分析，且成本远低于真空 MALDI 。在常压下，使用 AP-MALDI 源处理样品具有显著优势：简单便捷，不涉及真空操作；电离更软，减少源内分解；也能适宜挥发性基质和样品。AP-MALDI 与 ESI 源快速互换，与主流品牌的多种质谱兼容，充分发掘质谱的高分辨、高质量精度、及高通量定量能力。
图1展示了马里兰大学药学院开发的用于检测 S 蛋白的AP-MALDI HRMS 肽质量指纹图谱的示意图，实现了灵敏、高效、简便、准确地筛查 SARS-CoV-2病毒。
图1. AP-MALDI HRMS 新冠病毒 S 蛋白筛查流程示意图
设备材料
01
AP-MALDI（ng）离子源（MassTech, Inc.，固态 Nd:YAG 激光器，波长355 nm）
02
AP-MALDI 源与 Q Exactive HF 质谱仪（QE-HF，Thermo）联用检测 SARS-CoV-2 中的 S 蛋白。该方案同样适用于其他品牌的质谱，如安捷伦和 SCIEX 等。
03
试剂：乙腈(ACN)、水(H2O)、甲醇(MEOH)、三氟乙酸(TFA)，均为色谱级。
实验方法
试剂准备
1. AP-MALDI 基质：10 mg/mL CHCA，溶剂为70:30（v/v）ACN:0.1% TFA 水溶液。
2. 制备 AP-MALDI 多肽校准标准液，在70/30 ACN:0.1% TFA（水中）中浓度为10 pmol/mL，用于信号优化，5 μL 肽混合物和5 μL CHCA 按1:1混合。
3. 取1 μL 完全混合的上述标准溶液，在干净的常规192孔 MALDI 靶板上点靶，风干。
样品制备：蛋白质沉淀、烷基化、还原、酶解
该方案可应用于血液（血浆或血清）、唾液、鼻咽（NP）液和组织。以血浆为案例。
1. 1000 μL 冰甲醇加入200 μL 血浆中，涡旋混合30秒并在冰上储存30分钟，离心10分钟。去除上清液，在水中以0.1%TFA 重新悬浮颗粒。采用 BCA 法测定蛋白质含量。
2. 使用试剂盒酶解沉淀蛋白样品的胰蛋白酶。
3. 酶解后，使用快速真空干燥反应混合物，并将其重新悬浮在50 μL 的0.1%TFA 的水中，样品储存在-20°C 直到分析。
4. 混合 MALDI 基质和样品溶液1:1，取1 μL 混合液到 MALDI 靶板。
AP-MALDI 检测多肽指纹谱
1. 将靶板点样后放入 AP-MALDI。
2. 基于多肽混标的参数设置如表1。
3. 按表1的设置采集样品的质谱图，观察是否存在特异性多肽的信号，示例参见图3。
表1 AP-MALDI 源及 MS 质谱参数
图2. 多肽标准溶液 AP-MALDI HRMS 谱图
图3. S 蛋白 Trypsin 酶解液 AP-MALDI HRMS 谱图
● 文献来源
SARS-CoV-2 Spike Protein Detection using AP-MALDI Mass Spectrometry
Daniel J. Deredge1, Eugene Moskovets2, and Jace W. Jones1
1University of Maryland, School of Pharmacy, Department of Pharmaceutical Sciences, 20 N. Pine Street, Baltimore, MD, 21201 USA
2MassTech Inc., 6992 Columbia Gateway Dr., Suite #160, Columbia, MD 21046 USA
Keywords: COVID-19, SARS-CoV-2, AP-MALDI
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| 标签： | 原位质谱；质谱成像 |
