AIMS Virtual 系列丨脑内胆固醇空间代谢成像

发布时间： 2022-05-30 16:06 来源：华质泰科生物技术（北京）有限公司

2015年，美国发布新版《居民膳食指南》，不再限制胆固醇摄入量。因其并非直接反应血液中的胆固醇水平，存在个体代谢差异。

胆固醇与心血管疾病相关性的世纪争论由来已久。不过，今天我们要谈的是大脑中的胆固醇。

实际上，胆固醇是维持人体新陈代谢不可或缺的脂类，广泛存在于动物体内，尤以脑组织中最为丰富，与衰老特别是神经退行性疾病相关，如帕金森病或阿尔兹海默症等。

血液中的胆固醇因存在血脑屏障不能进入大脑。脑中胆固醇主要由大脑自行合成，且分布不均，代谢活跃度也不一致。因此，我们需要对大脑不同功能区的胆固醇代谢进行精确成像。

英国斯旺西大学医学院将两种原位电离技术 AP/MALDI 和 LESA Plus 与 Orbitrap 质谱联用来对脑组织切片（10 μm 厚）中的胆固醇及其代谢物进行高空间分辨率（＜10 μm 分辨率）或高灵敏度（pg/mg）成像。《2021 AIMS Virtual 原位质谱网络研讨会》上（点击查看），William J. Griffiths 教授在报告中展示了这些技术在鼠脑和人脑中的应用成果。

胆固醇代谢物含量比胆固醇本身至少低2~3个数量级，为了提高离子化效率和灵敏度，研究人员使用 SunCollect 基质喷涂仪对鼠脑中胆固醇及其代谢物进行原位衍生化，并用同样的方法加入氘代同位素内标（600 ng/μL）。

图1. 原位衍生化流程图

图2. 胆固醇衍生化反应

实验设计：开发一种适用于小鼠大脑不同区域中不同甾醇和氧化甾醇（包括胆甾烯酸）的低水平定量测定的 MS 方法。

图3. LESA 脑组织取样后留下的痕迹的显微镜视图

图4. LESA-LC-MS 运行原理图

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图5. （A）GP-衍生化胆固醇在不同脑区分布（MALDI成像）（B）全脑中9个不同脑区

图6. LESA-LC-MS 分析小鼠大脑切片，不同物质在不同脑区的分布差异。（A）胆固醇、（B）地甾醇、（C）8-DHC、（D）24S-HC 和（E）24S, 25-EC。（F）艾伦脑图谱显示 Cyp46a1分布

24S-羟基胆固醇（24S-HC）是胆固醇的主要代谢物，占总代谢物50%。它在9个脑区分布的有显著差异，丘脑（thalamus）和纹状体（striatum）中含量最高，分别达到1.637±0.159 ng/mm²和1.805±0.158 ng/mm²，而在小脑灰质中含量仅为0.161±0.024 ng/mm²。最高和最低含量差异高达10倍，而其他胆固醇代谢物在不同脑区分布差异仅为2~4倍。图6. D 展示了 LESA 指示的24S-HC 在不同脑区的分布差异，红色为高含量区，蓝色为低含量区。

图7.（左）胆固醇及代谢物在不同脑区的层次聚类分析图。每个柱形表示一只小鼠，圆点数为切片数，柱形下方数字为取点数。（右）24S-HC 在不同脑区差异大小的树状图。

经过层次聚类分析（hierarchal cluster analysis），两两比较不同脑区的24S-HC 含量，结果显示所有脑区的24S-HC 均存在显著性差异（图6.G和H），且大部分p＜0.001。

有趣的是，24S-HC 与其前体胆固醇（图7.A）分布并不相同。而将24S-HC 与艾伦脑图谱（Allen Brian Atlas）的 Cyp46a1酶分布进行对比，发现两者分布规律一致（如图6.F 所示）。Cyp46a1 酶可将胆固醇转化为24S-HC，它的高表达可以减少亨廷顿病（HD）模型小鼠发病，因而有种亨廷顿病的基因疗法就是诱导产生 Cyp46a1酶。所以，可以通过24S-HC 分布获知 Cyp46a1表达。

尽管由 Cyp46a1介导的胆固醇转化为24S-HC 是胆固醇主要的转化方式，Cyp46a1^-/-动物与野生型的全脑胆固醇含量并无显著差异。这可以解释为Cyp46a1^-/-动物体内胆固醇合成减少，课题组设计了以下实验来验证这一说法。

图8. 胆固醇合成和转化代谢流程图，红框部分所示，由于 Cyp46a1缺乏，如果胆固醇合成减少补偿了无法代谢的部分（即DHCR7减弱），则24S，24S，25-环氧胆固醇（24S，25-EC）含量应减少。

实验结果证明在 Cyp46a1^-/-小鼠中24S，25-EC 明显降低（见图9纵坐标轴），DHCR7 引起的胆固醇合成减弱弥补了 Cyp46a1缺失引起的胆固醇代谢受阻，而且不同部位所受影响不同。在丘脑和纹状体中，24S,25-EC 降低80%~90%，而在髓质和小脑中，仅降低约50%。

图9. 24S,25-EC 在野生型小鼠（A）和 Cyp46a1^-/-小鼠（B）不同脑区的含量分布

此外，课题组研究了其他多种胆固醇代谢途径和分布。这项工作证明了 LESA 和（AP）MALDI 联用在代谢途径和分布研究中的意义，（AP）MALDI 可达到10-50 μm 的高成像空间分辨率，LESA 可高灵敏度覆盖0.01-500 ng/mm²浓度范围，本研究中检测限（LOD）为0.001 ng/mm²，定量限为0.01 ng/mm² （CV＜25%），结合 SunCollect 高精度喷涂仪添加内标和原位衍生化，可以进一步提高这两种成像方式的灵敏度和稳定性。这将是研究健康和病变组织特定区域的有力工具，可用于即时评估检测组织中胆固醇及其代谢物的变化和分布。

现场互动：

Q：如何确保胆固醇已经完全氧化，该方法可以用于研究其他脂质吗？

A：在做测试实验的时候，没有检测到未被氧化的胆固醇。这种衍生化是针对酮基（ketone），因此只要是酮，都可以使用这种方法。有些含磷的试剂可以衍生化氨基（amino）。并且，在原位衍生化时，没有发现空间分辨率降低。因此，我想给大家推荐这种方法，值得一试。

● 文献来源：

Eylan Yutuc, William J. Griffiths, et al. Localization of sterols and oxysterols in mouse brain reveals distinct spatial cholesterol metabolism. Proc Natl Acad Sci USA. 117(11) (2020) 5749-5760.

www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1917421117

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