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“菌”说丨静态 LESA 原位质谱法表征大肠杆菌菌落中的完整蛋白质
大肠杆菌（Escherichia coli）出现于1.3亿年前，而后和脊椎动物结下不解之缘。在人体内，它如影随形，是肠道共生菌，亦敌亦友。
饮食习惯和所处环境会影响体内肠道菌丛的构成。有些菌株在非洲或亚洲大陆很常见，另一些则多见于欧美。
当大肠杆菌及其同伙占据领地后，会阻止可能致病的外来微生物进驻。比如，在国外生食果蔬常常闹肚子，多因互不相容的陌生菌株在肠道里狭路相逢、大打出手……
大肠杆菌是科学家青睐有加的模型生物，屡立奇功。但在这个庞大家族，也有一些成员兴风作浪，有着“世界上最具破坏性的五种病菌之一”的名头。
知己知彼，百战不殆。
原位质谱是分析细菌菌落的理想方法，诸如，静态 LESA-MS 曾用于直接于放线菌表面筛选抗生素（点击链接查看）。
来自英国伯明翰大学和英国国家物理实验室的研究人员，使用 LESA-MS 对培养皿中生长的活菌菌落直接取样，自上而下原位分析完整蛋白，而无需样品制备。
菌落培养 将大肠杆菌 K-12菌株接种到琼脂培养基上，培养皿直径6厘米。在 21℃ 培养3天，然后 4℃ 条件下储存，或在室温 20℃ 下生长。 表面直接采样 将培养皿放置于 LESA 样品盘，萃取溶剂为乙腈/水混合物（含1%甲酸）。LESA 以1滴溶剂直接从生长的大肠杆菌菌落中提取完整蛋白质，自动化移至芯片喷嘴，纳喷离子化并注入质谱分析。 LESA，即（芯片）多通道纳喷源（Triversa NanoMate）的四合一模式中的第四种，液滴萃取表面分析。LESA 样品盘可保持低温至 4 °C。 LESA-MS 分析 LESA 液滴萃取表面分析与高分辨质谱仪耦合，气压 0.3 psi，电压 1.75 kV，全扫描模式。为鉴定蛋白质，选择与完整蛋白质相对应的离子并进行 CID 碰撞诱导离解，然后根据大肠杆菌蛋白质数据库搜索得到的 MS/MS 数据。
图1、实验装置：A. LESA 样品盘；B. x、y 坐标的通用转接板复印件；C. 固定贴纸；D. 大肠杆菌菌落；E. 含琼脂的培养皿；F. 溶剂盘。培养皿中的菌落无需任何前处理（甚至无需酶解），即可进行蛋白分析。 图2、LESA 分析琼脂样品的示意图，“接触式” LESA 取样提高了取样精度。 a. 通过液滴萃取的非接触式，仅菌落表面和溶剂接触 b. 直接接触式，菌落表面和移液管尖端接触 c. 非接触式的液滴覆盖范围 3.68 mm d. 接触式的液滴覆盖范围 0.55 mm（可以更小，至几十微米）
Top-Down LESA-MS of E. coli Colonies LESA-MS 自上而下分析大肠杆菌菌落 图3、琼脂上生长的大肠杆菌 K-12菌落的 LESA-MS 分析（4℃）。（a）全扫描质谱；（b）菌落上红色标记为 LESA 采样区域；（c）截取放大的 m/z 900-1300 区段质谱图，包含对应蛋白质离子的大多数峰。 图4、以 m/z 923.51（含10+电荷）为中心的离子的 CID 二级谱图，经鉴定为 DNA 结合蛋白 HU-β。
通过“自上而下”的蛋白质组学分析成功鉴定6种完整蛋白，其功能涵盖了从逆境相关到 DNA 结合。
DNA 结合蛋白 HU-α 和 HU-β，能够包裹 DNA，在极端环境条件下稳定并防止其变性。DNA 结合蛋白 H-NS，可增加 DNA 的热稳定性，并在低温下抑制转录。YjbJ 是一种在大肠杆菌中高度丰富的蛋白质。CspA 是一种冷休克反应蛋白，在低温下诱导。抗应激蛋白 BhsA 在一系列应激条件下被诱导，包括剧烈的 pH 变化、热休克、重金属和过氧化氢的存在。这种蛋白通过抑制细胞聚集来抑制生物膜的形成，在应激条件下提高细胞活力。
图5、不同培养环境下，大肠杆菌产生的应激反应蛋白变化的 LESA-MS 谱图。（a）4℃ 培养2天；（b）室温 20℃ 培养3天；（c）室温 20℃ 培养10天。符号表示已识别的应激反应蛋白，红色标记为采样位置。
为研究大肠杆菌在极端环境下产生的应激反应蛋白，分别将大肠杆菌放在 4℃（对大肠杆菌而言是寒冷环境）培养2天和 20℃（室温）培养3天。结果发现，4℃ 环境的大肠杆菌产生了大量冷休克反应蛋白 CspA，而室温中的大肠杆菌则很少产生此蛋白。
结果表明，LESA-MS 适于自上而下直接鉴定活菌菌落中的完整蛋白。该方法有助于微生物学研究，可用于观察细菌生长、传播及其对外部因素的反应（如药物和 pH 值等）。
此外，“接触式” LESA 方法提高了采样精度，可用于细菌菌落的空间轮廓分析或污染表面的分析，对临床诊断、质量控制和环境检测产生积极影响。
更多微生物相关应用，请见下回分解。
● 参考文献： Elizabeth C. Randall, Josephine Bunch, and Helen J. Cooper. Direct Analysis of Intact Proteins from Escherichia coli Colonies by Liquid Extraction Surface Analysis Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 2014
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文章来源：华质泰科服务平台 微信公众号
| 标签： | 原位质谱，蛋白组学 |
