岛津成像质谱显微镜应用专题丨毛发类

由Equine Racing Co.，Ltd.的首席执行官Masaru Sese先生提供

1.简介

在法医学领域，除尿液作为药物测试样品外，毛发样品也在不断引起研究者注意。由于通常药物作为尿代谢产物接收检测时，如果没能在药物清除前采集到尿液样品，就无法检测出来。而毛发中的药物则不会代谢掉，并且停留时间很长。换言之，尿液中的药物可能会在最后一次摄入后几天内，由于代谢和排泄的关系排除体外，而毛发样品的特点在于只要不修剪，即可长期保留摄入历史。

目前，已将气相色谱质谱（GC-MS）和液相色谱质谱（LC-MS）等常规手段作为检测毛发样品的新方法，投入实际使用。采集的毛发经洗涤、干燥后，切割为约5mm至25px长度，经提取、纯化后，进行分析。人类毛发平均每月增长25px，如果可以确定所测毛发的位置，即可确定“何时使用过药物”、“使用过何种药物”以及“用量多少”。请关注Ono、Mizuno 等人的文献，该文献作为法医学领域的毛发分析提供参考，包括上述样品预处理方法(1) - (3)。

当前此类毛发分析方法不仅在人来源样品，同时在赛马药物检测领域引起了极大关注(4)(5)。迄今报告用于马毛分析的测试样品均来自马鬃毛（以下简称“马毛”）。但是，马毛通常较长，需要充分洗涤和干燥来去除样品表面的污染物。另外，由于切割后所得样品数量很多，前处理过程也会十分麻烦。

鉴于此，目前除GC-MS或LC-MS方法以外，已有报道使用质谱成像（MSI）技术进行毛发分析的新方法。利用MSI，经预处理的毛发样品可被直接分析。近年来，Kamata等发表使用MSI检测人类毛发中药物摄入史的开创性论文(6) (7)。使用MSI检测毛发中的药物摄入史，则必须沿纵向去除毛发角质层，露出髓质。该过程十分困难，因此如参考文献6所述，尽管制造专用装置进行该步骤，依然无法去除长度超过约1-50px的角质层。与人的毛发不同，马的鬃毛很长，从而导致这一过程变得更加麻烦，因此目前尚未有在马毛中进行检测药物摄入的报道。本文将介绍使用MSI技术检测马毛中甾体抗炎药磷酸地塞米松的应用实例，该马毛样品长100px，经手动方式去除角质层。

2.质谱成像

在质谱分析时，分子被离子化，根据其在电场和磁场中的位移差来测量其质量（实际为m/z值，将质量除以离子所带电荷数）。如前所述，MSI与使用现有GC-MS和LC-MS方法的不同之处在于，无需进行提取，可直接分析样品表面，获得待测药物空间分布信息。

通常的实验步骤包括准备样品切片，并将其放置在ITO导电玻璃上。随后样品被电离并进行质谱分析。在分析时，确定样品检测区域和测量点间的间隔，获取每个测量点的质谱图及对应位置信息。获取所有测量点质谱图后，选择与目标分子对应的m/z，并根据其强度分布获得目标分子的定位信息。与常规成像技术不同，IMS不需要进行免疫化学染色或GFP标记等。由于直接获得分子量信息，可区分目标化合物的原型及其代谢物；由于能够同时电离多种化合物并进行质谱检测，可在一次分析中获得多种不同物质的定位信息。

3.iMScope TRIO的开发理念

目前，可以在多种质谱仪上进行MSI实验，可选择的离子源以及质谱种类也是各种各样。自2004年以来，作者与岛津株式会社(8)合作开发iMScope TRIO™成像质谱显微镜，目前正在大阪大学岛津分析创新研究实验室(9)进行各种相关应用研究。

iMScope TRIO的开发理念如图1所示。尽管普通显微镜可以观察组织结构，但很难获取相关各种组分的信息。另一方面，iMScope TRIO将对样品的显微观察和基质辅助激光解吸电离（MALDI）技术相结合从而进行成像质谱分析。

图1 iMScope TRIO™成像质谱显微镜的理念

使用常规显微镜，可区分样品结构上的差异，但是难以获取相关化学成分的信息。相比之下，iMScope TRIO™可同时进行光学显微观察和质谱检测，获得对应组分的强度分析信息。

4.实验方法

图2 本研究中使用的分析设备

（A）iMLayer™：基质升华仪，（B）iMScope TRIO ™：成像质谱检测，以及（C）iMScope TRIO ™系统的示意图。该系统在大气压下进行样品的显微镜观察，并使用MALDI电离方式，生成的离子引入离子阱并由飞行时间质谱仪进行检测。

本研究使用iMLayer™基质升华仪进行MALDI基质涂敷（图2（A））。所用基质为α-氰基-4-羟基肉桂酸（α-CHCA，Merck）和9-氨基吖啶（9-AA，东京化学工业有限公司），分别用于正离子模式分析和负离子模式分析，通过iMLayer在样品表面上涂敷厚度为0.5 μm的基质。正离子模式分析中，基质升华后，使用喷枪手动喷涂α-CHCA溶液（10   mg/ml，使用30％乙腈/0.1%甲酸溶液）(10)。负离子模式分析中，9-AA升华后，将5％的甲醇蒸气喷覆于样品表面3秒钟，进行重结晶(11)。

使用iMScope TRIO进行检测（图2（B），（C））。如上所述，iMScope TRIO配有光学显微镜，可在大气压下获得样品表面图像，同时配置大气压MALDI离子源。MALDI所用激光器为Nd:YAG激光器，频率为1 kHz。在大气压下产生的离子通过差级真空系统导入质量分析单元，并由离子阱飞行时间质谱仪检测。质量范围（m/z）在   50-3000之间，本次目标药物磷酸地塞米松为小分子药物，质量范围设定至m/z 1000。

图3（A）分析流程和（B）马毛表皮去除方法

在立体显微镜下使用冷冻切片机刀片去除角质层，暴露出髓质

图3（A）显示该样品的的分析流程。基本过程：采集马毛、去除角质层、涂覆基质、使用iMScope TRIO检测成像。用浸有蒸馏水的布擦拭所采集每一束马毛的表面。该方式仅针对MSI可行，因为MSI无需提取即可直观分析样品。相反，在已有方法中，如清洗不充分，在提取过程中会发生污染问题。清洁马毛表面后，立即干燥马毛。将干燥后的马毛固定于黏贴导电双面胶带的ITO载玻片（Matsunami Glass Ind.，Ltd.）上，并使用切片刀在立体显微镜下从毛囊末端开始去除角质层，如图3（B）所示。由于马毛的直径约为人类毛发直径的两倍（约200μm），因此即使通过手动操作，也可轻松去除表面。除去角质层后，将剩余附着于ITO玻璃载玻片上的毛发作为待测样品，涂覆基质并进行检测。

本研究所使用药物为地塞米松磷酸钠（DexaSP），为一类甾体类抗炎药。DexaSP可使用9-AA基质直接以负离子模式进行检测。或者，通过用吉拉德T试剂（GirT）对DexaSP进行衍生化，提高正离子模式的离子化效率（图4）⁽¹²⁾。

图4 地塞米松磷酸钠（DexaSP）是靶向药物

如进行正离子模式检测，将以Gir T试剂作为衍生试剂生成的DexaSP衍生物作为检测目标。

对于负离子模式检测，将无变化的DexaSP作为检测目标。

5.结果

图5显示使用标准品在正离子模式和负离子模式获得的检测结果。

图5标准品的检测结果

正离子模式和负离子模式均可获得信号，但考虑前处理的简便性和离子强度的差异，选择负离子模式进行检测。

如前所述，在正离子模式检测中，将GirT衍生后的DexaSP衍生物作为检测目标，而在负离子模式检测中，将无变化DexaSP作为检测目标。正离子模式下， 使用α-CHCA   检测，DexaSP衍生物的质荷比为m/z   586.267，对应[GirT-DexaSP-2Na + 2H] +离子。另一方面，负离子模式中，使用9-AA检测， [DexaSP-H]- 的质荷比为m/z 471.160。

两种模式下均观察到DexaSP由来的峰，但鉴于前处理所需时间且负离子模式强度约高出正离子模式100倍，决定使用9-AA在负离子模式下对马毛进行检测。

分析可疑马毛样本时，需进行对照实验，检测未给予DexaSP的马毛样品，确认没有m/z 471.160离子的出现（图6（A））。图6（B）显示地塞米松磷酸酯给药后马毛的质谱成像结果。

图6马毛中DexaSP分布检测结果

（A）是未给药马匹的马毛检测结果，作为阴性对照；（B）给药后马匹的马毛中检测结果（注射15-20 mL由Fujita Pharmaceutical Co.提供的0.1％地塞米松磷酸钠水溶液，浓度1.315 mg/mL， 连续注射3天）。用iMScope TRIO™扫描从毛囊开始4 cm长度的马毛样本，记录每1 cm马毛的检测结果，在距毛囊16.48 mm处观察到较强的目标药物信号。由于马毛平均每月以2.0 cm的速度生长，可判断在采样日期前25天给药。

测试样品为2017年7月13日采集的马毛，该马匹在2017年6月上旬，连续3天注射15至20 mL 0.1％的地塞米松磷酸钠水溶液（Fujita Pharmaceutical Co）。iMScope TRIO的测量间隔在x方向上为80 μm，在y方向上为5 μm，激光斑点大小为2（系统参数）。

在该实验中，测量总长为100px的马毛，将其划分为25px的区间分别进行检测。在图6（B）中，所得数据虽然分为4个部分，但马毛样本并未被分割：100px长的马毛被固定在ITO载玻片上。

从毛囊向尖端进行扫描，并在距毛囊约16.48 mm处，检测到较高强度地塞米松磷酸酯信号。该结果是首次从毛发中直接检测到原本会于体内迅速代谢的磷酸酯，具有重要意义。此处质谱成像结果使用绝对强度来表示峰强度，并在300-1500强度范围内以多色带显示。在这一结果中暖色表示较高的峰强度。

6.讨论

本实验中，根据目标化合物离子化效果选择负离子模式进行分析，成功在马毛中检测出目标药物。给药后的马毛样本中，在距毛囊16.48 mm位置处观察到较强的药物信号。马毛的平均生长速度为每月50px，是人类的两倍。基于该生长速率以及最大强度信号距离毛囊的位置估算给药时间，大约在24-25天前。根据给药记录，该药物在采集毛发前约一个月给药，通过对比该信息，认为药物定位正确。

另一方面，尽管离子强度较低，但是在毛囊附近依然检测到一些信号。经确认质谱图，发现该信号源自噪声，由此认为进一步提高离子化效率和信噪比对分析实际样品十分重要。为达到这一目标，可能需要进一步改进基质涂覆方法或选择其他基质。

7.总结与展望

地塞米松磷酸钠是一种经获准使用的抗炎药，但禁止在比赛前使用(13)。最近一次在2016年12月东京大奖赛上，冠军赛马阿波罗肯塔基在赛后发现使用过这一药物的事件依然记忆犹新。本次结果是将iMLayer基质升华与iMScope TRIO成像质谱分析相结合，应用于违禁药物检测领域的首个示例。

此外，由于磷酸酯可在体内迅速代谢，直接在毛发中检测到未变化药物同样是一项十分重要的成果。另一方面，由于在成像结果中存在大量噪声，有必要对毛发预处理流程进行进一步优化，提高离子强度。从该检测结果来看，探索对可检测药物（包括合成类固醇类）定量分析方法的建立也是必不可少的。尽管该应用仍存在许多问题以待解决，但我们依然认为iMScope TRIO的潜力十分值得期待。

8.马毛分析的可能性

当前，世界范围内关于赛马违禁药物控制的讨论很多，讨论赛马违禁药物检测和赛马伤害保护（ICRAV：国际赛马分析专家和兽医会议）的国际会议每两年召开一次。2018年，在阿拉伯联合酋长国的迪拜举行该会议，作者首次参加并介绍了这项研究结果。图7显示了会场和Meydan赛马场的景色。能够在世界顶级赛马场之一的Meydan赛马场旁会议厅中展示这项研究，是迄今为止作者一生中最难忘的事件之一。

通常，来自日本的参会者均为JRA相关人员或赛马化学实验室的研究人员，而作者则是大学中唯一的参会者。不仅如此，来自香港赛马会、澳大利亚赛马会和其他地方的研究人员对使用IMS进行药物检测产生了浓厚兴趣并寄予厚望，讨论非常活跃。

2018年11月，在撰写本文时，岩手赛马比赛中参赛的赛马Ubatouban被检测出使用禁用药品去氢睾酮(14)。今后，作者将继续改进和优化该检测方法（包括简化毛发前处理技术），使这种来自日本的新型检测方法在世界赛马领域中用以进行违禁药品检测。

作者同时还得到岛津制作所的大力支持，并与Equine   Racing Co., Ltd.的全体员工进行广泛合作，其中来自Equine   Racing Co., Ltd.的代表人也是本文的合著者。

作者将在图8中展示马毛采样图片以及作者和合著者的最新照片作为本文的结尾。

图7 ICRAV2018

（A）、（B）ICRAV 2018会场的场景，（C）举行ICRAV的Meydan赛马场倾城。Meydan赛马场景色壮观，其规模和完备程度在日本也数一数二。

图8参观Equine Racing Co., Ltd.

（A）Equine Racing Co., Ltd.的工作人员介绍马匹。（B）在马腿上可以看到的称为“栗子”的部分：角质化的退化拇指（C）鬃毛采样 （D）作者（右）和合著者（左）的近期照片。

参考资料

(1)Masahiro Ohno (2005) Asahi Law Review, 32, 144-199

(2)Dai Mizuno (2017) Analysis, 12, 589-590

(3)Shima N et al. (2017) Drug. Metab. Dispos., 45, 286-293, https://doi.org/10.1124/dmd.116.074211

(4)Wong JKY et al. (2018) J. Pharm. Biomed. Anal., 158,   189-203, https://doi.org/10.1016/j.jpba.2018.05.043

(5)Madry MM et al. (2016) BMC Vet. Res., 12, 84, https://doi.org/10.1186/s12917-016-0709-5

(6)Kamata T et al. (2015) Anal. Chem., 87, 576-81,   https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.5b00971

(7)Hang W, Ying Wang (2017) Anal. Chimica Acta, 975,   42-51, https://doi.org/10.1016Zj.aca.2017.04.012

(8)Harada T et al. (2009)   Anal. Chem., 81,9153-7,   https://doi.org/10.1021/ac901872n

(9)https://www.shimadzu.co.jp/labcamp/

(10)Shimma S et al. (2013) J. Mass Spectrom., 48, 1285-90,   https://doi.org/10.1002/jms.328

(11)Nakamura J et al. (2017) Anal. Bioanal. Chem., 409, 1697-1706, https://10.1007/s00216-016-0118-4

(12)Shimma S et al.(2016) Anal. Bioanal. Chem., 408, 7607-7615,   https://doi.org/10.1007/s00216-016-9594-9

(13)http://company.jra.jp/0000/law/law07/07.pdf

(14) http://www.iwatekeiba.or.jp/news/180915i

本文中描述的产品尚未获得日本《药品和医疗设备法》批准，尚不能用作医疗设备。该设备不能用于医学检查、治疗或相关程序。

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