使用全自动液体萃取平台ATLAS-LEXT在全血样品中药物、毒物提取QuEChERS法中的应用

传统农药成分分析预处理方法（QuEChERS方法）是一种在法医学中毒分析的有效的预处理方法。适用于全血样品中药物、毒物提取。

本方法是一种可以提取多种成分稳定且可靠的样品预处理方法。但传统QuEChERS方法均为手动操作流程，特别样品量较大时传统手工难以应对，需要很长时间才能完成操作。

本应用介绍了以全自动方法进行QuEChERS萃取流程的案例，以省力、高效和提高样品预处理精度为目的，学会所发表了运用全自动液体萃取平台ATLAS-LEXT进行全血样品预处理方法开发及方法学评价的相关内容。

实验方法

▶ 试剂    

阿普唑仑Alprazolam、溴西泮Bromazepam、溴替唑仑Brotizolam、氯硝西泮Clonazepam、地西泮Diazepam、依替唑仑Etizolam、氟硝西泮Flunitrazepam、氟西泮Flurazepam、尼美西泮Nimetazepam、硝西泮Nitrazepam、奥沙西泮Oxazepam、三唑仑Triazolam和卡马西平Carbamazepine、奎硫平Quetiapine、唑吡坦Zolpidem，共计15种（全血样品中添加浓度为1~200ng/mL）   

▶ 预处理    

采用QuEChERS自动化方式预处理供LC/MS分析: ATLAS-LEXT自动预处理流程见图1。取添加上述药物的120μL血液样品的试管A，加去离子水振荡，稀释5倍。取含有QuEChERS提取盐*0.1g和2个不锈钢珠的试管B，加乙腈2000μL和内标溶液20μL，振荡30秒钟，向试管B中添加试管A稀释血液样品500μL，振荡3分钟，在2000×g下离心5分钟，防乳化传感器确认后取上清液2000μL，转移至试管C中。氮气吹干后加甲醇250μL，振荡30秒后再溶解，移取至自动进样器瓶中待分析。（所需时间: 30分钟/样品）。

图1 QuEChERS法+ATLAS-LEXT自动提取全血中药物的流程

* QuEChERS盐试剂：Q-sepTM QuECHERS提取盐试剂盒MgSO4 6g，NaOAc 1.5g。

QuEChERS法+dSPE纯化法的自动样品预处理（GC/MS用提取法）样品预处理流程见图2。取添加药物的全血样品120μL置于试管A中，加去离子水混合，稀释5倍。取QuEChERS提取盐*0.1g和2个不锈钢珠的试管B，加乙腈2000μL和内标溶液20μL，振荡30秒钟，向试管B添加试管A中血液样品500μL，振荡3分钟，2000×g下离心5分钟，防乳化传感器确认后取上清液2000μL，转移至含有分散固相提取剂dSPE**0.1g的试管C中，振荡120秒，2000×g下离心2分钟。取上清液2000μL，移至试管D中，用氮气吹干。加入甲醇250μL，振荡30秒再溶解，移取并注入自动进样瓶。（所需时间: 40分钟/样品）    

图2 QuEChERS提取法+dSPE纯化法在ATLAS-LEXT中自动提取全血中药物的流程

本应用还介绍了利用LC/MS进行测定的示例，通过改善干固试剂、使用不同的定容试剂或衍生化试剂制备样品，待分析萃取样品也可适用于GC/MS分析。    

▶ 回收率的测定和基质效应的验证

取用添加浓度为10ng/mL和50ng/mL的血液添加样品，在ATLAS-LEXT上进行自动化预处理，制得待分析样品溶液，加内标阿普唑仑-d5，测定各药物的回收率。血液经过提取后采用加标萃取样品溶液计算获得的峰面积，并验证基质效应。

▶ 定量性及残留物的验证

在1~200ng/mL的范围内制作每种待测物的标准曲线，对QC试样中的10ng/mL和50ng/mL样品同步测试分析，计算准确度及精度。连续对血药浓度为200ng/mL的加药试样进行预处理，然后测定空白试样，验证没有目标物残留。

** 分散固相提取剂 dSPE...Q-sepTM QuECHERS 纯化试剂盒MgSO4 150mg，C18 50mg

实验结果与考察

▶ 回收率和基质效应的验证

根据本方法获得的色谱图见图3，每种待测药物的回收率和基质效应的结果见表1。各药物的回收率总体良好，采用QuEChERS提取法，当浓度为10ng/mL时，回收率≧80%；当浓度为50ng/mL时，回收率≧82%。采用QuEChERS提取+dSPE纯化的制备方法时，在纯化时移液管的操作增多，故回收率低于单独提取时的回收率，但获得的数值不妨碍实际应用。此外，当浓度为10ng/mL时，基质效应为78~111%；当浓度为50ng/mL时，基质效应为95–110%。

图3、MRM谱图

▶ 定量性的验证  

根据内标法绘制每种待测药物的标准曲线，结果显示，所有标准曲线呈现良好的线性关系，范围为1~200ng/mL，R2为0.999以上。对QC试样进行分析，10ng/mL和50ng/mL试样的分析结果见表2。在任何浓度下均可以取得良好结果，且精度在7%以内，准确度在±16%以内。

▶ 残留物的验证

连续处理血药浓度为200ng/mL的高浓度加药血样，然后测定空白试样，结果显示，LC-MS/MS未检出峰，亦未发现残留物。

表1 各药物的回收率和基质效应

表2 标准曲线的验证（n=5）

总结

我们详细验证了添加溶剂和提取盐的含量、移液时的针位的高度等内容，开发出一种尽可能减少提取过程中目标物损失的程序。方法学验证结果表明，其可以自动化的执行手工预处理的全部程序。    

1. 使用QuEChERS提取盐的乙腈提取法（LC/MS用提取法）

2. 使用QuEChERS提取盐的乙腈提取法+dSPE纯化处理的试样制备法（GC/MS用提取法）

我们详细验证了添加溶剂和提取盐的含量经确认，2种操作方法都没有残留发生。本法具有稳定的操作性、良好的定量重现性，是一种具有极高实用性的自动化萃取方法。    

* 参考文献：日本法中毒学会第37届年会演讲摘要锦集P-12

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