生物技术药物质量控制，液相色谱大显身手

导 读

生物技术药物（以下简称生物药）主要指采用DNA重组技术或者其他创新生物技术生产的一大类预防、诊断和治疗疾病的药物，是医药行业冉冉升起的明星。主要成员有抗体药物、重组蛋白和多肽、核酸和寡核苷酸、疫苗、干细胞和免疫细胞工程等。这些新型药物在肿瘤、慢性病、遗传罕见病、新冠肺炎流行病等疾病防治上各显神通，比如抗击癌症的猛将抗体药物、新冠肺炎战线上的后起之秀mRNA疫苗、又或者是近期刷屏的治疗遗传罕见病的天价寡核苷酸药物，都在为广大患者解除病痛、改善生活质量上屡立奇功。

为什么生物药研发有挑战性呢？

如此奇效的生物药，开发和生产却是困难重重，比化学药物投入成本更高、周期更长。比如开发一个创新生物药需要耗费至少10亿美元，约10~20年的周期。为什么生物药的研发这么有挑战性呢？主要是由于生物药具有分子量大、结构复杂和可变性、容易受到各种理化因素影响等特点，在生物发酵（细胞培养）、目标产物的分离纯化等复杂生产过程中存在异变性，为药物的有效性和安全性的评价带来了很多考验。

岛津生物技术药物解决方案

液相色谱篇

基于生物药的结构复杂性和异变性，需要对其进行全面的检测和质量控制，以保证产品的安全和有效。岛津密切关注生物药质量研究和控制，继推出《蛋白类生物技术药物开发和临床试验解决方案》后，细化生物药研究领域，又推出了《生物药杂质与辅料分析解决方案》，本次结合近期的研究成果，特推出《岛津生物技术药物解决方案——液相色谱篇》应用文集，聚焦液相色谱在生物药质量研究和控制中的应用。

解决方案内容

一、一般抗体类药物分析

1.1. 聚集体分析

1)生物兼容液相系统Nexera Bio分析Fc融合蛋白多聚体

2)生物兼容液相系统Nexera Bio分析贝伐单抗生物类似药多聚体

3)生物兼容液相系统Nexera Bio分析阿达木单抗聚集体

4)生物兼容液相系统Nexera Bio分析双抗样品的大小异质性

1.2. 电荷异质性分析

1)生物兼容液相系统Nexera Bio分析贝伐单抗生物类似药电荷异质体

2)生物兼容液相系统Nexera Bio在单抗样品电荷异质性分析中的应用

1.3. 肽图分析

1)使用一体化液相色谱仪i-Series进行抗体药物肽图分析

2)使用Nexera LC-40和LCMS-2020对曲妥珠单抗进行肽图分析

1.4. 糖型分析

1)超高效液相色谱法用于抗体中唾液酸的测定

2)利用超高效液相色谱仪连接荧光检测器和四极杆飞行时间质谱仪对曲妥珠单抗游离N糖进行分离与鉴定

二、抗体药物偶联物分析

1)疏水作用色谱法（HIC）在抗体药物偶联物（ADC）药物抗体比值（DAR）和药物分布测定中的应用

2)抗体药物偶联物的药物抗体偶联比的检测

3)ADC原液中DMA溶剂残留的检测

三、mRNA、重组蛋白和多肽药物分析

1)生物兼容液相系统用于核酸药物纯度分析

2)生物兼容液相系统Nexera Bio联合蒸发光散射检测器测定mRNA递送介质DMG-PEG2000的含量

3)生物兼容液相系统Nexera Bio联合蒸发光散射检测器测定抗体药物中吐温80的含量

4)尺寸排阻色谱法测定重组人干扰素α2a注射剂中主成分含量

5)尺寸排阻色谱法测定重组人干扰素α2b注射剂中主成分含量

6)体积排阻色谱法用于注射用重组人白介素-11的纯度分析

7)利用Nexera LC-40方法转移功能，建立卡贝缩宫素注射液有关物质UHPLC测定法

典型案例，先睹为快

1生物兼容液相色谱分析双特异性抗体大小异质性

非片段化设计的双抗分子量较大，通常需要采用尺寸排阻色谱法（SEC）对其大小异质性行分析，反映双抗连接情况，保障产品质量。

双抗样品分离色谱图

分离度和重复性结果

该双抗样品中各色谱峰峰形良好，分离度均大于1.5，分离良好。保留时间和峰面积的RSD %分别在0.02~0.03 %和0.12~0.64 %之间，方法重复性好。

2生物兼容液相分析抗体药物偶联物（ADC）的药物抗体比（DAR）值

药物抗体偶联比（DAR）是抗体所连接药物数量的平均值，是ADC的关键质量属性。疏水作用色谱是检测抗体药物偶联物DAR值的常用分析技术，通常采用非变性的色谱条件，可使ADC药物保持完整的状态。疏水作用色谱能将不同DAR值的组分分开，从而能直接测定不同DAR值组分的比例。

ADC药物疏水作用色谱图

ADC药物负荷分布和DAR计算

注：平均DAR=Σ（加权峰面积）/100；谱图中较小的a峰是偶联3个药物的组分。

使用疏水作用色谱测定了ADC药物实际样品，得到了该药物的DAR分布，并计算了该药物的平均DAR。

3超高效液相色谱联合荧光检测器分析曲妥珠单抗N糖谱

单抗药物功能的实现与其糖基化修饰密切相关，糖基化修饰会影响蛋白的性能，如构象、稳定性、溶解度、药物代谢动力学、活性及免疫原性等。2020版《中国药典》第三部新增了《3130-单抗N糖谱测定法》指导原则，我们参考该指导原则建立了曲妥珠单抗游离N糖谱分析方法，方法分离度好，重复性好。

曲妥珠单抗N糖谱连续进样色谱图（n=6）

4一体化液相色谱分析曲妥珠单抗肽图

HPLC肽图分析不但可以比较生物类似药与原研药一级结构的一致性，还可以通过不同批次产品的肽图的比较来验证工艺稳定性，因此肽图分析在蛋白类生物药质量控制中至关重要。

曲妥珠单抗酶解样品连续进样色谱图

（n=6，280 nm）

曲妥珠单抗酶解产物形成的众多色谱峰得到了高效分离，六次重复进样的重复性良好，方法稳定可靠，适用于肽图一致性评估。

5生物兼容液相联合ELSD分析抗体药物辅料吐温80含量

吐温80是抗体药物生产中用到的一种辅料，可减少蛋白聚集以及蛋白在容器表面的吸附。但吐温80本身及其降解副产物可能会对人体健康造成威胁，故建立抗体药物中吐温80的含量检测的方法对控制药物辅料安全性具有重要意义。

抗体制剂T-1和T-2中吐温80色谱图

我们开发了一种检测抗体药物中吐温80含量的方法，并应用于两种抗体制剂中吐温80含量的测定，两种抗体制剂中吐温80的含量分别为144.3 μg/mL和404.1 μg/mL。

结语

生物药具有治疗针对性强、用量少、疗效好且安全性较高等优点，近年来得以飞速发展。生物药质量控制是生物药安全有效的保证，是生物药生产的关键环节。岛津液相色谱性能卓越、稳定耐用，是生物药质量控制的好帮手。《岛津生物技术药物解决方案——液相色谱篇》（←点击查看）应用文集，汇集岛津生物药液相色谱分析新方案，涵盖双特异性抗体、抗体药物偶联物（ADC）、mRNA疫苗等时下热门的生物药物。

撰稿人：唐雪

*本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。

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