单细胞转录组测序

单细胞RNA-Seq通过对单个细胞的mRNA进行逆转录和PCR扩增，使用高通量测序手段，对单细胞中mRNA进行基因表达定量、功能富集、代谢通路等分析。它可以解决传统RNA定量技术在早期胚胎发育、干细胞、癌症、免疫等研究领域中存在的样品量极低或细胞异质性的问题，是在单细胞水平研究基因表达强有力的工具，极大地拓展了RNA-Seq的应用范围。

碧云天高通量测序与数据分析技术服务项目表：

备注：质检首次免费，如果样品首次质检不通过，后续再进行质检每样加收100元。核酸抽提与质检、自制文库质检以及数据分析报价如下。

碧云天高通量测序样品制备与质检技术服务项目表：

注：以上样品制备与质检技术服务项目仅作为高通量测序的配套服务，不单独提供相应服务。

碧云天高通量测序技术服务询价与订购：

1. 请您下载并填写《 碧云天高通量测序服务询价表》，发送至ngs@beyotime.com，我们将为您设计最佳方案。

2. 若有订购意向，碧云天的高通量测序技术服务人员会与您联系，并签订《碧云天高通量测序技术服务协议书》。

3. 送样时，请下载并填写《碧云天高通量测序生物样品信息表》，发送至ngs@beyotime.com或碧云天高通量测序技术服务人员邮箱。样品的具体要求参见《碧云天高通量测序生物送样要求》。

碧云天高通量测序技术服务优势：

1. 技术经验丰富：碧云天拥有强大的技术团队，具有多年的核酸纯化试剂盒开发经验，在核酸样品处理方面有丰富的操作经验。

2. 分析能力强：碧云天有专业的生物信息分析团队，为您提供完善的分析服务。

3. 服务全面快速：碧云天有多年的试剂研发经验，有完备的分子生物学产品线和完善的生物技术服务体系，可为您后继实验提供跟踪服务。另外，我们承诺以最快的速度去解决您遇到的问题。

4. 实验平台灵活：碧云天现在主要利用主流的Illumina平台为主，可以根据实验目的和要求灵活运用不同的实验平台的优势。

5. 性价比高：碧云天以最优惠的价格为您提供最全面的服务，帮助您有效节约实验成本。

碧云天高通量测序技术服务客户须知：

1. 样品寄出前，请给ngs@beyotime.com或碧云天高通量测序技术服务人员邮箱发送一份填写完整的电子版《碧云天高通量测序生物样品信息表》；如有特殊情况，请在快递发出前与碧云天高通量测序技术服务人员电话联系，比如客户自送样品、提前寄送样品、有其它物品随样品一起快递需要额外点收等，以便安排人手，防止丢失。

2. 请将填写完整的纸质版《碧云天高通量测序生物样品信息表》以及其它技术资料(如有)密封于塑料袋内，随样品一起寄出；协议书和硬盘(数据量较大，需硬盘存储)请另单快递给对应接收人员，不要与样品一起快递，既避免物流分拣环节导致合同和硬盘遗失，也避免干冰或蓝冰冷凝水可能损坏文件和硬盘。

3. 如果需要进行生物信息学分析，请在《碧云天高通量测序生物样品信息表》的“项目描述”栏目里注明。

4. 样品置于1.5ml或其它型号的低吸附离心管里；管上清楚标明样品名称，样品管上的名称要与《碧云天高通量测序生物样品信息表》一致，请双人核实无误；用parafilm膜把样品管缠紧密封好；将样品管置于保护用的50ml离心管或其它容器里，用适量纸、纱布或棉花塞紧，防止样品管晃荡，旋紧盖子。

5. 根据样品类型选择室温、蓝冰或者干冰包装，选择最快的运输方式以免样品降解；合理安排发货时间，避免周六、周日或法定节假日到达，以免样品丢失。低温运输采用安全的干冰，不要用危险的液氮；液氮如果渗进样品管，在温度发生变化时因体积膨胀有可能导致爆炸，毁坏样品。

6. 项目结束后，剩余样品免费保存6个月；如果需要延长保存期或者返还，请提前与碧云天高通量测序技术服务人员联系。

7. 其它详细的样品要求请见《碧云天高通量测序生物送样要求》。

碧云天单细胞转录组测序技术服务项目明细：

单细胞转录组测序：通过对单个细胞mRNA逆转录和PCR扩增，使用高通量测序，对单细胞中mRNA进行基因表达定量、功能富集、代谢通路等分析。它可以解决传统RNA定量技术在早期胚胎发育、干细胞、癌症、免疫等研究领域中存在的样品量极低或细胞异质性的问题。

技术流程

MALBAC扩增原理技术优势

1. 运用MALBAC多重退火环状循环扩增技术，精确反转录某一单个细胞在某一状态下的几乎所有转录本序列信息mRNA并进行扩增。解决了扩增对微量初始模板过大的扩增偏移，使得单细胞中90%的基因组能够被测序，样品起始量可低至0.5pg。

2. 无物种的限定：要求mRNA有Poly A尾结构，GC％为35％-65％。

3. 分辨率高：单碱基分辨率。

4. 覆盖度高：能覆盖到几乎所有转录本片段序列。

5. 检测范围广：从几个到数十万个拷贝精确计数，可同时鉴定及定量正常和稀有转录本。

技术参数

测序平台与方式：HiSeq, PE150
测序数据量：建议6Gb/样本
测序及基础分析周期：30个工作日

样品要求

1. 样品要求样品类型：已分离的单细胞样本或去蛋白并进行DNase处理后的完整Total RNA。

2. 样品需求量（单次）：样品建议为单细胞或RNA总量≥10pg，最低起始量≥0.5pg。

数据分析内容

标准信息分析

1. 原始数据过滤：对原始数据去除接头序列、污染序列及低质量reads

2. 数据质量评估：对过滤前后的测序数据进行质量评估

3. 参考基因组比对分析：将过滤后数据map到参考基因组上

4. RNA-Seq质量评估：评估测序的饱和度、覆盖度等

高级信息分析

1. 有参转录本组装：根据比对结果将转录本组装起来

2. 转录本/基因表达分析：根据比对结果，计算转录本/基因的表达量

3. 差异表达分析：通过假设检验，计算两两组间转录本/基因的差异表达的显著性

4. 差异基因聚类分析：通过聚类分析，绘制差异基因的聚类热图

5. 差异基因富集分析：将差异表达的基因进行GO和KEGG Pathway富集分析

6. SNP分析：基于转录组数据分析其中的SNP和InDel

7. SSR分析：分析转录本序列上的SSR

8. 新转录本分析：新的转录本

9. 差异可变剪接分析：分析两组间差异的可变剪接事件

10. 共表达网络分析：基于表达相关性，绘制差异基因共表达网络图

11. 蛋白互作网络分析：映射数据库中的蛋白互作关系，绘制差异基因蛋白互作网络

应用案例

利用多重退火环状循环扩增(MALBAC)技术扩增单细胞转录组
Chapman AR, He Z, Lu S, Yong J, Tan L, Tang F, et al. (2015). Single Cell Transcriptome Amplification with MALBAC. PLoS ONE 10(3): e0120889. doi:10.1371/journal.pone.0120889

目前，多重退火环状循环扩增 (MALBAC) 技术已经被用于单细胞全基因组的扩增, 此技术是用半线型来代替传统的指数型扩增方式，从而可以达到高覆盖度。本实验利用MALBAC 扩增单细胞转录组，并一致性地得到高效、高精度和可重复的结果。以此技术成功扩增和测序了来自3个胚层的小鼠原肠早期胚胎单细胞，从而在单细胞水平检测中皮层细胞胞间上皮间质转化过程。

来自3个胚层的7.0dpc小鼠胚胎干细胞中的基因表达谱

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注：该产品未在中华人民共和国食品药品监督管理部门申请医疗器械注册和备案，不可用于临床诊断或治疗等相关用途