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手把手教你攻克PCR困难模板

发布时间: 2020-08-07 16:01 来源:默克生命科学

我太“南”了

PCR算是实验室最磨练耐心的实验之一了,好不容易完成了样品准备、核酸的提取,然而PCR之后没有产物,是漏加了试剂,还是酶失活?换上新试剂,格外小心,重来一次,没用啊!,依然P不出条带。内心无比凄凉,悲伤逆流成河。

本来做个PCR研究都够难了,现在还偏要碰到“困难模板”,小白不哭,没有条带不要着急,学姐总结经验,带你攻克各路PCR困难模板。

高GC含量模板

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难点

DNA序列中,G-C之间的三对氢键通常需要较高能量解链,模板很难打开,易形成复杂的二级结构,DNA聚合酶难以推进。因此高GC含量(G+C>=60%)DNA序列在常规PCR条件下比较难扩增。

解决方案

  • 选用专门针对GC-RICH PCR系统试剂盒:
    包含高合成能力的DNA聚合酶,这类酶对DNA模板的亲和力较高,更适合扩增困难靶标

  • 添加1~2M betaine
    betaine在PCR混合液里可以保护DNA聚合酶免被高温变性伤害,还能促进DNA-蛋白质复合物的稳定,提高扩增效率。

  • 添加2~5% DMSO
    DMSO可以降低DNA的二级结构。但DMSO也会降低Taq polymerase的活性,因此DMSO的使用浓度需要优化。

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长片段模板

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难点

长片段DNA序列在PCR过程中易损伤,使其断裂或脱嘌呤,导致长片段PCR无法进行。Taq酶具有一定的错配率,导致产物链3‘端出现错配碱基,链合成提前终止。非特异性扩增也会干扰长片段的延伸。

解决方案

  • 使用专为长片段PCR设计的PCR系统试剂盒:包含兼具矫正功能的DNA酶和高合成能力的DNA聚合酶,这类酶能够在短时间内扩增长片段。

  • 设计较长的长片段PCR引物(21~34bp),提高反应特异性,减少错配率。

  • 适当降低延伸温度,同时根据模板长度加长延伸反应时间(通常1kb/min)。

  • 缓冲液体系需提高Tris的浓度或改用Tricine缓冲液以增强缓冲能力,使缓冲液的pH不会降的过低而影响酶活性。

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低纯度模板

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难点

低纯度模板中可能含有PCR抑制剂残留,如蛋白酶K、苯酚和EDTA;残留的盐分或离子,如K+,Na+等也可能会抑制DNA聚合酶,从而影响PCR扩增。

解决方案

  • 选择合成能力高,对抑制剂耐受力高的DNA聚合酶,比如,把野生型Ta酶通过Directed Evolution工程化修饰的KAPA2G DNA聚合酶。

  • 使用70%乙醇再纯化DNA,去除残留盐分或离子。

  • 把模板适度稀释,再加入反应体系中,减少抑制物的影响。

  • 若存在EDTA其它金属螯合剂,需要适当提高能与EDTA结合的 Mg2+浓度

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低浓度模板

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难点

模板浓度是决定Ct的最主要因素,需控制在一个合适范围内,使Ct在15-35之间。低浓度模板不仅会影响PCR效率降低得率,甚至无扩增产物。

解决方案

  • 选择高灵敏度,高合成能力的DNA聚合酶。

  • 避免样制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

  • 再次扩增PCR产物,得到更高的目标DNA得率

  • PCR扩增无产物时,可以适当提高Mg2+浓度终浓度范围1~4 mM)。

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工欲善其事,必先利其器,做PCR的小伙伴,快快选取以下利器,帮助你攻克PCR模板难题,实验加速度吧~

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标签:PCR,PCR检测,PCR精选试剂
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