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成与败?默克蛋白质谱样品制备超全指南来帮你

发布时间: 2020-05-27 15:32 来源:默克化工技术(上海)有限公司

Description: 默克为您提供蛋白质谱上机前蛋白样品制备的几个核心环节和解决方案:蛋白基础功能探究(结构、相互作用核酸/蛋白/蛋白组、修饰功能等),蛋白鉴定(定位、机理等),蛋白定量等。

研究过蛋白的人都能深刻体会其复杂性和多功能性,为解决蛋白研究的困境,应运而生了一系列技术、方法、仪器等。质谱技术就是其中一个典型代表,常被用于几个蛋白研究的重要方向:蛋白基础功能探究(结构、相互作用核酸/蛋白/蛋白组、修饰功能等),蛋白鉴定(定位、机理等),蛋白定量等。

很多初入门者一般谈“谱”色变,不仅因为机器技术门槛高,而且对于上机样品的质量要求极高。质谱仪性能的迭代更新为我们提供了更高的精度、更快的速度、更多的鉴定效率,而建立成熟完善的样品前处理方法才是最重要的环节。

依据蛋白样本的来源种类,质谱样品一般分为细胞、组织、体液(血清、血浆、脑脊液、尿液等)。

图1. 基于质谱的定量蛋白组工作流程

以下为大家整理了质谱上机前蛋白样品制备的几个核心环节和解决方案。

1蛋白提取

1. 细胞或组织样品裂解

细胞裂解及高效地蛋白提取对于高质量的蛋白纯化至关重要。以下提供针对细菌、哺乳动物、酵母和植物细胞的裂解方案,以取得较之传统物理裂解法更高的蛋白得率,甚至可从细胞样品中选择性提取目的蛋白及总蛋白的、亚组分蛋白,以及线粒体、叶绿体、细胞核、高尔基体及溶酶体等重要的细胞器。这些产品可与大多数亲和纯化方法相兼容,并且可以最大程度的保留蛋白活性,以备下游分析之用。

表1. 重组蛋白提取相关产品

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 表2. 天然蛋白提取相关产品

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蛋白抽提过程中为防止蛋白降解,及时对蛋白酶进行抑制是很有必要的,比如MSSAFE系列质谱专用蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物,成功避免了任何抑制剂成分带来的对蛋白的修饰,且不含金属螯合剂,与IMAC兼容。

2. 体液样本预处理

体液样本在biomarker的发现中有重要意义,虽然目前还没有通过质谱筛选或鉴定的方法发现的biomarker,但科学家们正在尝试改良低丰度蛋白的富集和鉴定效率。这就需要我们能高效地去除体液样本中的高丰度蛋白,如Albumin,IgG,transferrin等。相比市面上只能去除2种、12种的高丰度蛋白试剂,Seppro系列可去除多达50多种的中高丰度蛋白,富集到占总蛋白1%的低丰度蛋白。除了人类体液样本Seppro® 还有试剂盒用于小鼠和大鼠样品的处理,以及从植物样品中去除二磷酸核酮糖羧化酶。

图2.人血浆蛋白组中高丰度蛋白分布图

表3. 高丰度蛋白去除相关产品

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2蛋白定量

蛋白质种类繁多且结构不均一,分子量相差也很大,功能各异。生物实验室中蛋白定量以Bradford法(B6916 Bradford Reagent)、BCA法(71285 BCA Protein Assay Kit)、考马斯亮蓝染色法最为常用。

3蛋白酶解

从蛋白到多肽的消化步骤对于酶的要求极高,蛋白质组级别的胰蛋白酶保障了出色的序列覆盖度,同时消除了模糊的自溶性MALDI 峰。Trypsin Profile IGD kit 可实现从PAGE 直接到MALDI 的进行快速高效完善的消化过程。Protease Profiler 提供了4 种经验证的蛋白酶,可代替胰蛋白酶,进行MS 前的蛋白质消化步骤。

表4. 质谱级蛋白酶解相关产品

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4蛋白标记

发现蛋白组学(Discovery proteomics)中既可以用label-free的方式,也可以用基于iTRAQ,TMT,SILAC等标记方法的分析。例如以下iTRAQ试剂。

表5. 推荐的iTRAQ试剂

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5肽段富集

对消化后或标记后的多肽进行有目的性富集,比如糖肽(高甘露糖型、杂糖、复合型糖基化肽)、磷酸化多肽、胍基化、泛素化蛋白,可以用于后续更有针对性的分析。

表6. 肽段富集相关产品

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质谱仪一般惧怕样品中含盐,所以对肽段脱盐非常有必要,但样本珍贵,需要保证高回收率且快速高效进行分析物的吸附/洗脱,且后续能直接用与质谱、HPLC、毛细电泳分析。如以下Supel-Tips和ZipTip系列。

表7. 脱盐相关产品

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如果样本体积较大需进行浓缩,则需要选择对蛋白吸附损失最低、回收效率最高的材料,比如以下Amicon系列浓缩管、超滤管。

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图3. 浓缩、超滤及透析相关产品

6上机鉴定

完成以上核心步骤后,还需要对仪器进行校准。仪器校准一直以来依赖厂家工程师,但低效和费时,所以找到灵活简便的校准方法可大大提高效率。ProteoMass MALDI校准试剂盒是业界广泛认可的高品质校准产品,专门为MALDI-MS 应用开发,经过严格测试,不含盐和金属离子,改善目的分子的电离效率,同时避免产生导致光谱模糊的加合物。

对于定量蛋白组学,很重要的一点是要选择标准品。默克可为您提供通用蛋白质组学标准品和蛋白质组学差异动态范围标准品作为质谱研究的参照标准品。这两组标准品均包含相同的48种人类蛋白,分子量在6,000至83,000道尔顿之间。其中的每个组份蛋白都经过HPLC纯化及AAA定量。

表8. 质谱校准和标准品相关产品

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综上,Mass spec中样本制备是蛋白组学分析的最关键步骤,样品抽提和制备的质量和可重复性直接显著影响到下游质谱的分离和鉴定能力。

图4. 基于样品类型的样本制备方法小结

 


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