血液中药物小分子高灵敏度LC/MS分析的诀窍

      随着生活水平的提高，人们的关注重心已经从温饱问题转移到更高的追求：精神水平的提升和个人生命的长度。增加人类寿命，势必要克服各种各样疾病的困扰。现代医学的研究重心在于尽早发现和精准治疗，表现为生命体中生物标记物（Biomarker）的浓度水平和治疗药物的代谢过程等研究。

目前，医院临床实验室中的特定诊断通常使用免疫检测和分子检测手段，交叉反应和干扰较为严重；作为替代手段，LC/MS基于色谱和质量选择性对化合物进行分离，灵敏度更高；可有效监控治疗药物，节省时间和成本。

     影响LC/MS实验结果的因素较多，在保证系统运行基础上，如何保证高灵敏度的实验结果呢？可从以下两方面考虑：

1.   前处理

在LC/MS分析中，干扰物与分析物共流出，会影响液滴形成或引起共电离等问题，造成

分析物离子化水平不稳定。

磷脂类化合物是分析血液中生物样品时，造成离子抑制的一个主要原因：

磷脂类化合物结构

传统的血液前处理方法，包括蛋白沉淀、液液萃取和固相萃取存在或多或少的局限性，例如只能沉淀克级蛋白和与目标分析物共萃取等。

默克全新的固相萃取产品HybridSPE^®-Phosphorlipid，基于物理和化学作用，可同时有效去除血液中的蛋白和磷脂，提高液质检测的灵敏度。

HybridSPE^®产品

96孔板规格的HybridSPE进行“仿真沉淀”：

维生素D及相关代谢物的LC/MS实验

维生素D可以促进儿童骨骼增长，降低老年人骨质疏松等。维生素D缺陷，自发现以来，一直是研究重点。维生素D以两种形式存在：维生素D₂和维生素D₃ ，两者在肝脏中进行代谢。其中25-羟基类代谢产物浓度水平，可用于维生素D相关疾病的诊断依据。最近研究表明，将非活性的3-epi维生素代谢产物与其他代谢产物分离开，更有助于疾病研究。采用LC/MS对代谢产物浓度研究的关键，在于血液中相关蛋白的去除。

维生素D及相关代谢物的结构和分子量信息

维生素D及相关代谢物在色谱柱Ascentis Express F5（150 x 2.1 mm, 2.7 μm）上的分离

维生素D及相关代谢物经不同前处理方法得到的回收数据对比

基于Ascentis Express F5色谱柱的选择性，可建立一个快速有效的LC/MS方法，用于体内维生素D代谢物的研究。采用HybridSPE^®，对血液样品进行处理，去除其中的磷脂和蛋白，可有效提高分析方法的重现性、稳定性和回收率。

2.     溶剂

     溶剂等级不同，其所含有的杂质含量不同， LC-MS分析时会产生不同的基线背景和噪音，影响检测的灵敏度：

通过注射泵将两种不同级别的乙腈直接注射入MS系统

为保证高灵敏度的LC/MS分析，需采用高级别的溶剂，以利血平作为示例。

利血平测试

将利血平标准品通过注射泵注入MS系统，将所得的信号强度与背景噪音强度进行比较：

不同等级溶剂下得到的利血平LC/MS图谱

对利血平的分子离子峰的信噪比进行计算：

不同等级溶剂下得到的利血平分子离子峰信噪比值

利血平分子离子峰信噪比值结果表明，采用超梯度级的乙腈，所得到的信噪比值不仅高于梯度级乙腈得到的结果，而且明显高于其他两个品牌LC/MS溶剂测得的信噪比值。

结论：

为保证高灵敏度的LC/MS分析结果，可从两方面着手：

1.       采用HybridSPE^®对样品中的磷脂和蛋白进行高效去除；

2.       采用超梯度级的乙腈，降低LC/MS分析中的背景值，提高分析峰信噪比。