FDA 中LC-MS/MS法检测双氰胺方法简介

FDA 中LC-MS/MS法检测双氰胺方法简介
    —默克密理博检测婴幼儿奶粉中双氰胺方法
默克密理应用实验室2013-1-31

 
双氰胺极性较强，易溶于水，中性及酸性条件下易电离，适合使用默克密理博的两性离子型亲水作用(ZIC®-HILIC)色谱柱分离。FDA 在Bulletin 4487中采用ZIC®-HILIC色谱柱，建立了测定乳品、蛋白质等基质的样品中包括双氰胺在内的LC-MS/MS测试方法，现把该方法样品处理及检测条件简要列出。
 
同时默克密理博致力于分析方法的开发，为客户提供简便、快速的解决方案，我们采用ZIC®-HILIC 色谱柱在HPLC-UV条件进行了摸索，为客户提供快速简便的测试方法。
 
默克密理博双氰胺检测专用柱

 
LC-MS/MS检测婴幼儿奶粉中双氰胺(FDA Bulletin 4487)
 
FDA #4487方法^[1]中建立了同时检测奶粉及高蛋白产品中可能存在添加的六种含氮物质(环丙氨嗪、双氰胺、尿素、缩二脲、三缩脲、脲基甲脒)分析方法。方法中采用2%的甲酸水溶液提取，再加入乙腈进行蛋白沉淀。提取物使用默克密理博的ZIC®-HILIC色谱柱在液质联用(LC-MS/MS)仪器上分析，在脱脂奶粉、奶粉、大豆蛋白、面粉、麦麸和谷物基质中进行标样添加测试并进行了方法验证，该方法测试双氰胺 Dicyandiamide (DCD)的平均回收率为 98.1% ，RSD=5.6%，在脱脂奶粉中测试的检测限（LOD）为20ppb，定量限为60ppb.
 

LC-MS样品处理方法^[1-2]

1.称取一定量的奶粉，加10倍温水溶解，得奶粉母液样品。称取奶粉母液样品(2.0±0.02g)于50ml PP管中，方法空白样品量取2.0ml水；
2.方法摸索的样品可在PP管中加入相当于1ppm的双氰胺对照品；.校准曲线用的样品可在样品管中分别添加相当于0.8-8.0ppm的双氰胺对照品；
3.每根PP管中加入18mL 2%的甲酸水溶液，振摇60秒，使所有固型物分散开。为了方便快速移取溶液，可设置5.0mL的移液器量程到4.5mL，连续移取4次即得18mL。加入提取液的PP管超声30分钟，再振摇1分钟，放入离心机中离心20分钟（4500rpm）。
4.移取离心后的上清液50ul，于1.5ml离心管中，加入950ul乙腈。在加入乙腈后，会有白色沉淀，可适当振摇30秒，再放入离心机中离心10分钟。离心后，吸取上清液，用0.20um PTFE膜过滤至2ml自动进样瓶中。必要时可取滤液100ul，加入500ul的乙腈-2%甲酸水溶液（95/5）稀释后再进行测试。
 

测试条件

色谱条件
色谱柱：ZIC®-HILIC (5 µm, 200Å) PEEK 150x2.1 mm(货号:1.50454.0001)
流动相：A: 95:5 乙腈:0.1%甲酸水溶液（含10mM甲酸铵）
B: 50:50乙腈:0.1%甲酸水溶液（含10mM甲酸铵）
流动相比例：0-5min，100%A.
注:由于双氰胺保留时间在3.4min左右，可在5分钟内完成分析。无需运行文献[2]的梯度程序。必要时，采用100%的B相机进行色谱柱的冲洗。
进样量：2-5ul（FDA方法中采用20ul)
质谱条件
离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫；检测方式：多反应检测（MRM）；去簇电压:36V；双氰胺的分子离子[M+1]+ m/z:85.0,子离子m/z:68.0,43.1.

FDA方法测试结果

双氰胺的保留时间tR=3.4min. 检测限LOD=20ppm，定量限LOQ=60ppb,加标回收率在93-101%，低、高两个浓度下的RSD值分别为5.9%和5.3%.

我们采用LC-MS专用的色谱柱(ZIC®-HILIC (5 µm, 200Å) PEEK 150x2.1 mm)在Agilent1260 HPLC上进行测试，218nm下的色谱图如下：


双氰胺保留时间3.1.3min，其中蓝色-奶粉样品；绿色-奶粉加标；红色-双氰胺对照品(1.25ug/ml)。流动相：95:5 乙腈:0.1%甲酸水溶液（含10mM乙酸铵），进样量均为2ul.
 

HPLC方法检测婴幼儿奶粉中双氰胺

为了方便HPLC的用户，我们采用ZIC®-HILIC HPLC色谱柱开发了相应的检测方法。

样品前处理
取婴幼儿配方奶粉2g于50mL PP管中，加18mL 2%的甲酸水溶液（2.2.4），加盖密闭。摇振60秒，再超声30分钟，取出，再摇振60秒，放入离心机中离心（4000转），20分钟。取出，吸取上清液50ul，于10ml PP管中，加入950ul乙腈，加盖密闭，振摇60秒，吸取溶液，过滤，即得供试液。
或取婴幼儿配方奶粉2g于50mL PP管中，加20mL 乙腈-甲酸水溶液（2.2.4），加盖密闭。摇振60秒，再超声30分钟，取出，再摇振60秒，静置，吸取上层溶液，过滤，即得供试液。（快速处理方法）
加标样品同法配制。样品配置方法亦可采用LC-MS/MS的处理方法。

色谱条件
流动相 (v/v): A-醋酸铵溶液（10 mM）,B-乙腈
比例*：A:B=12：88(必要时在方法中设置冲柱程序)
流速:1 mL/min
进样量：20ul

测试结果

 

图中蓝色为标样（1.25ug/ml）,绿色为奶粉空白，红色为奶粉加标(加入量10ug/g).

采用ZIC®-HILIC色谱柱，HPLC-UV下测试，无干扰，可用于双氰胺的快速检测。该方法处理方法简单，色谱峰型良好，方法重现性良好（RSD<3%）,检测浓度在0.5-10ug/ml之间现行关系良好(R=0.999),加样回收率在95.6-101.5%之间。按照方法1的处理，LOD为1.3ug/g奶粉，按照方法2处理,LOD可达0.07ug/g。

详细方法可参考：

[1] FDA Laboratory Information Bulletin 4487(双氰胺检测方法)
[2]Journal of Chromatography A 1220 (2012) 101–107
[3]FDA Laboratory Information Bulletin 4421(三聚氰胺检测方法)

其他相关详细方法，请联系默克密理博。

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