同位素标记与未标记化合物的含量如何测定？

同位素标记化合物的合成和生产中，很难获得纯品，如氘代、¹⁴C、¹⁵N等标记的化合物通常含有一定量的未标记化合物，虽然质谱法是检测和定量标记化合物的最广泛和最直接的方法，但是标记和未标记的化合物的各种同位素的A和A+1，…，A+n峰的质谱峰信号重叠相互重叠，使得尤其是存在多个标记位置的环或存在Cl、Br元素的化合物，他们的质谱信号重叠更为复杂，即使是使用高分辨率的质谱系统（如TOF、Orbitrap）也难以准确解决定量的问题。

尽管一些文献报道中提出了各种质谱信号的重叠校正方案，但即使在50%（50﹕50）高浓度的标记与未标记混合物，其校正误差也大于±10%，这使得对5-10%的低浓度的混合物的可靠定量几乎不可能实现的。

通过MassWorks的TrueCal^TM技术对测量的质谱信号峰进行峰形校正，来提高质谱系统对同位素峰型的谱图准确度（Spectral Accuracy），以确保使用多元最小二乘法拟合能从校准的质谱图中计算出每个同位素峰的“真实”贡献。

实验及结果

考察两种同位素峰分布复杂度不同的化合物：第一种是含有一个Cl原子的D2标记化合物——Hydrochlorothiazide-3,3-d2 (HCT-d2)，第二种是含有两个Cl原子且¹⁴C 标记在苯环上的化合物——双氯酚酸钠。选择了三种质谱系统来评仪器定量分析同位素标记物的的适用性：ThermoFisher LTQ/Orbitrap、Agilent LC/MSD和WatersXevo TQ LC/MSMS。 在每个MS系统上，首先在Profile模式下测量纯的未标记化合物，然后将其进行峰形校正，以评估可实现的谱图准确度。 再利用谱图准确度，对同位素标记的两种化合物进行计算来获得它们中含有的各种标记和未标记离子的相对浓度。

D2标记含Cl化合物——HCT-d2

未标记的HCT（C7H6N3O4S2Cl）在LTQ/Orbitrap下采集的Profile模式数据，使用MassWorks处理，获得的谱图准确度约为97.3%（见图1），标记后的HCT-d2的谱图准确度又有明显下降，仅为96.2%，将D2标记和未标记的HCT按50%：50%混合后的谱图准确度下降更为严重，只能达到92.5%（见图2），导致的结果就是MassWorks给出的两者的相对浓度出现了±10%的误差，这种误差下要准确计算标记和未标记的含量显然是不可能的。

图1 MassWorks软件在LTQ/Orbitrap下测定的HCT（C7H6N3O4S2Cl）的同位素谱图准确度

图2 MassWorks软件在LTQ/Orbitrap下测定的HCT-d2（C7H4N3O4S2ClD2）的同位素谱图准确度

将测试转移到单四极杆的Agilent LC/MSD系统上，测得的未标记的HCT的谱图准确度高达99.0%，标记的HCT-d2的谱图准确度为98.9%，50%：50%混合物的谱图准确度为98.7%（见图3），结果表明，单四极杆的LC/MSD的同位素谱图准确度测定准确。然后进一步考察HCT和HCT-d2按不同比例混合的MassWokrs定量测试效果，每一个浓度测定3次，然后数据对比实际的混合浓度和MassWorks软件计算出来浓度值，结果见图4，结果表明，平均浓度误差反映了测量偏差或系统偏差均小于0.6%，且要小于标准偏差（SD＜1%）。HCT-d2的实际混合浓度值与软件计算值的线性相关系数R²=0.9996，预测的标准误差SEP=0.53%。

图3 未标记的HCT（上）、标记的HCT-d2（中）、HCT/HCT-d2= 50:50的混合物（下），红色曲线为校正的同位素谱图，黑色为理论的同位素谱图

图4 使用MassWorks的分析得到的不同浓度HCT的定量分析结果

图5 HCT-d2的计算浓度与实际浓度的线性关系

¹⁴C标记含Cl化合物——HCT-d2

双氯芬酸钠(C14H10NO2Cl2Na)，含有2个Cl原子，苯环上可被标记的¹⁴C的数量为0~6个，¹⁴C标记后的化合物的同位素峰分布比HCT-d2更为复杂，使用LTQ/Orbitrap应对7种潜在共存混合物的准确定量任务来说是一个挑战。然而，当用Waters Xevo TQ LC/MSMS测量时，从供应商购买的放射性的¹⁴C标记化合物的谱图准确度达到了98.9%（见图6），MassWorks软件计算出来的0~6个¹⁴C标记化合物的各自的浓度比（图7），计算出来的总的放射性比活性为62.6%，这与供应商提供的62.7 mCi/mmol值非常一致。图8为按不同比例混合的标记和未标记化合物的定量分析结果，标记物的混合浓度值与软件计算浓度值的线性相关系数R2=0.9989，预测的标准误差SEP=1.98%。

图6 未标记双氯酚酸钠（上）和标记的双氯酚酸钠（下）的谱图准确度结果

图7 MassWorks给出的标记的双氯酚酸钠的校正质谱图及其中所有化合物的相对含量

图8 使用MassWorks的多元线性分析得到的不同浓度双氯芬酸钠的定量分析结果

图9 双氯芬酸钠14C标记物的计算浓度与实际浓度的线性关系