基于成像毛细管等电聚焦（iCIEF）的馏分收集和在线质谱联用技术用于表征治疗性抗体的电荷异质性

　近期，在Analytical Methods上发表的一篇文章，介绍了基于成像毛细管等电聚焦（iCIEF）的馏分收集和在线质谱联用的分析平台来表征抗体电荷异质性。抗体的电荷变异体经过iCIEF分离后：1）通过MS直接检测分子量；2）通过组分收集的方式获取异构体的纯组分，并用HPLC-MS分析其完整分子量。研究发现，由于iCIEF-MS的检测灵敏度高于HPLC-MS，因此能在mAb的电荷变异体分析中，iCIEF-MS能观察到HPLC-MS无法检测到的一些低丰度的糖型。这是因为iCIEF-MS中使用的流速（小于5 μL/min）远低于HPLC-MS中使用的流量（300 μL/min），较低的流速导致在ESI离子化时产生更高的溶剂蒸发效率和质谱效率。此外，iCIEF分离时的聚焦预浓缩也有助于提高灵敏度。

　　本文将对文章的部分内容进行介绍，如有感兴趣的读者，可阅读原文章以获取更多内容。

　　原文见：Anal. Methods, 2023, 15, 411

　　抗体的电荷异质性可能由于翻译后修饰（PTMs）、降解反应（如脱酰胺、C-末端赖氨酸加工和糖基化）而产生。电荷变异体的存在可能会导致产品功效和药代动力学改变、产品完全失活，或在最坏情况下增强免疫原性。

　　生物技术行业中最常见的电荷变异体检测方法包括离子交换色谱法（IEX）、传统等电聚焦法（IEF）和成像毛细管等电聚焦（iCIEF）。基于等电点（pI）分离的iCIEF技术正成为整个制药行业中蛋白质电荷异质性表征的金标准。此外，后续的质谱（MS）分析将为电荷变异体及其结构提供有力和全面的分析。尽管为此目的使用了不同的色谱-质谱联用技术，但大多数技术都不能准确区分具有微小等电点（pI）差异的蛋白质异构体。毛细管电泳（CE）与质谱联用一直被认为是生物制药的一种有效的分析策略，包括毛细管区带电泳法、cIEF和微流控毛细管电泳作为分离前端。具体而言，iCIEF和cIEF的快速、高分离分辨率与MS的分子量鉴定相结合，将为电荷异质性提供深度的分析。最近，iCIEF或cIEF已被证明是质谱检测时的一种强大的前端分离工具，但仍需要改进以应对更高灵敏度、更高通量和更人性化操作方面的挑战。

　　至于蛋白质电荷变异体的制备，传统的离线馏分收集技术，如等电聚焦（IEF）和自由流电泳（FFE），对于电荷变异体的制备来说，是一个更加繁琐的过程。此外，传统平板凝胶IEF方法收集的电荷变异体的数量和纯度通常不足以进行进一步表征。目前，IEX已经被用于蛋白质电荷变异体的馏分收集。尽管IEX和IEF都是基于电荷的蛋白质分离方法，但它们依赖于不同的分离原理，因此，蛋白质电荷变异体之间可能没有很好的相关性。由于IEX提供的分离分辨率较低，IEX馏分的纯度和盐含量通常不令人满意。在传统的毛细管电泳（CE）仪器上，传统CIEF样品区带的分离和收集是不实用的，并且在商业上是不可用的。因此，iCIEF分析、iCIEF-MS串联技术、制备iCIEF的馏分收集的集成平台成为一种非常理想的方法，可以增强蛋白质药物的电荷变异体表征能力。

　　在本研究中，使用了加拿大AES公司开发的一种集成的iCIEF平台，对一种治疗性单克隆抗体的电荷变异体进行表征。使用iCIEF分析模式对抗体的主成分及其四种电荷变异体进行了分析，并当完成蛋白质在分离毛细管内的聚焦后，以制备模式对两种主要的酸性和碱性电荷变异体进行馏分收集。收集的电荷变异体馏分在完整蛋白质水平上通过LC-MS进行表征，LC-MS的表征结果与使用iCIEF-MS表征的结果一致。该平台集成的三种iCIEF操作模式的可以通过更换定制的毛细管分离柱进行快速灵活地切换。蛋白质异构体表征的整体研究策略是追求分析方法的简便性、可靠性、准确性，而这种集成的分析平台将为生物制药行业的蛋白质异构体表征提供了全面的解决方案。

CEInfinite iCIEF分析兼制备型全柱成像毛细管电泳系统

　　iCIEF制备与iCIEF-MS

　　AES 公司的iCIEF制备技术可以实现高纯度、多异构体、带电蛋白质产物的分离、制备和收集，如图1A所示。蛋白质聚焦完成后，用低浓度酸溶液作为迁移溶剂，以100–160 nL/min的流速从注射泵中流出，将聚焦的蛋白质区带从分离毛细管中依次推出，观察到的变异体峰被馏分收集，整个迁移过程中需保持高电压。

　　iCIEF-MS系统采用了与馏分收集相同的压力迁移技术，如图1B所示，iCIEF与MS的连接不需要对离子源进行特殊修改，并且可以直接连接到来自不同质谱品牌的质谱仪离子源。在iCIEF分离过程中，使用的独特涂层的毛细管，使得iCIEF过程不需要添加聚合物MC和尿素。在50 nL/min流速下的0.1%甲酸迁移溶液和鞘液（水：乙腈=1:1 v/v，含有0.5%v/v甲酸）的作用下，毛细管中聚焦后的蛋白质区带被无缝地引入MS离子源。

　　iCIEF中的馏分收集和在线MS分析模式可以快速灵活地切换，只需更换定制的毛细管即可实现，而无需改变仪器配置。

图1:（A）iCIEF制备收集和（B）在线iCIEF-MS的原理

　　iCIEF-UV 分析mAb

　　如图2所示，在iCEIF-UV中使用100μm ID FC涂层毛细管很好地分离了mAb的主成分、酸性变异体（A1–A2）和碱性变异体（B1–B2）。整个iCIEF分析时间不到10分钟。表1中给出了基于蛋白质组分的峰面积和pI的物质百分比。蛋白质主成分和四种电荷变异体的pI在6.5–8.5 pH范围内，峰面积的重复性在RSD 5.0%以下（n=6）。观察到痕量的酸性峰A1和碱性峰B2，其百分比分别为5.4%和2%。酸性A2和碱性B1是主要的电荷变异体，其百分比分别为16.7%和21.0%。

图2：单克隆抗体的iCIEF-UV分析谱图

表1 iCIEF分析mAb的电荷变异体的pIs和相对峰面积

　　iCIEF制备用于mAb主成分和电荷变异体的馏分收集

　　在制备型iCIEF上使用320 μm ID的AD涂层毛细管柱用于分离mAb的主成分和两种电荷变异体（酸性A2和碱性B1），然后通过HPLC-MS进行完整蛋白质分析。如图3所示，所有预期的蛋白质电荷变异体的峰首先通过施加高电压沿着分离毛细管聚焦，然后由纳升注射泵将聚焦的蛋白区带迁移到转移毛细管中，用于组分收集。收集过程是自动化的，通过连续运行制备，能在三天内分离出50-100 mg蛋白质。如图3（左）所示，由纳升注射泵驱动的迁移过程允许蛋白质的聚焦区带移出分离毛细管，用于馏分收集。在迁移过程中，施加高电压以保持分离分辨率。图4证明了iCIEF制备对三个馏分的优异重复性，这足以确保通过多次制备获得足够多的高纯度蛋白电荷变异体组分。使用iCIEF-UV对收集馏分再次分析，结果表明三个馏分中每个峰的纯度都在70.0%以上，收集量在50 mg以上，相应的回收率在20-40%之间。在馏分收集之后，对三个收集的馏分进行HPLC-MS分析以进行完整分子量的鉴定（图6A）。随后可以通过LC-MS/MS的深度肽图谱表征来进行电荷修饰的鉴定，该研究正在进行中。

图3 iCIEF制备收集中的电荷变异体蛋白区带迁移过程

图4 主成分及其两种主要电荷变异体的组分收集的重复性（n=6）

　　iCIEF-MS分析mAb

　　iCIEF-MS系统它允许mAb样品在完整蛋白水平上快速筛选鉴定电荷变异体，且不需要进行馏分收集。iCIEF-MS使分离的蛋白质电荷变异体能够直接注射到高灵敏度MS中，从而保留了前端iCIEF的优异分离分辨率。而与MS接口的无缝连接是基于微流，低流速又能帮助提高质谱检测蛋白质的灵敏度。

　　如图6B所示，使用窄pH范围的两性电解质（pH 7-8）和200 μm ID MC涂层毛细管，在45分钟内通过iCIEF-MS成功表征了mAb的主成分和四种电荷变异体（两种酸性和两种碱性变异体），同时通过全柱成像检测记录了其在质谱检测前的iCIEF-UV图谱。由于采用了新型的MC涂层分离毛细管，这种iCIEF-MS在线联用策略避免了在样品缓冲液中使用MC溶液作为添加剂。本研究中建立的iCIEF-MS比报道的单点检测的cIEF-MS结果显示出更高的通量，单点检测分析时间超过1小时。此外，iCIEF-MS通过避免常规cIEF-MS所使用的繁琐的化学迁移，大大提高了可重复性。我们的研究表明，本研究中的iCIEF-MS灵敏度优异，尤其是对微量的变异体A1和B2，如图6B所示。

图6：（A）HPLC-MS和（B）iCIEF-MS分析mAb电荷变异体

　　iCIEF-MS与HPLC-MS分析mAb完整分子量的比较

　　主成分和两种电荷变异体（酸性A2和碱性B1）的MW鉴定利用收集组分的LC-MS分析和在线iCIEF-MS表征进行了比较（图7）。在iCIEF-MS的质谱中观察到了mAb的一些低丰度的糖型，但使用HLPC-MS方法没有检测到这些糖基化类型。这体现了iCIEF-MS的灵敏度要高于HPLC-MS，因为iCIEF-MS中所使用的流速（小于5 μL/min）远低于HPLC-MS中使用的流速（300 μL/min）。较低的流速导致更高的溶剂蒸发效率和质谱效率。此外，iCIEF分离中的聚焦预浓缩也有助于提高灵敏度。这项研究表明，该iCIEF-MS平台可以进行极其快速的指纹识别，并为可能识别靶向电荷变异体提供初步说明。收集馏分的LC-MS分析有助于在完整和肽图水平上进行深入表征。

图7：通过HPLC-MS对收集的馏分和在线iCIEF-MS对电荷变异体（A）主成分（B）酸性A2（C）碱性B1进行表征

　　这是首次在一台仪器上提供集成iCIEF-UV、馏分收集和iCIEF-MS联用的分析平台。以前，由于iCIEF中的蛋白质峰不能被收集或MS在线检测，当iCIEF分离完成时，必须使用传统的IEX、IEF和FFE来制备观察到的蛋白质电荷变异体。然而，由于IEX、IEF和FFE与iCIEF技术的分离机制和分辨率不同，所收集的馏分通常不能很好地与iCIEF的结果相匹配，并且由于长时间的操作过程和使用了较强烈的化学试剂，蛋白在馏分收集过程中往往会发生变性。而在本研究的中建立的制备iCIEF很好地解决了蛋白质电荷变异体制备中的这一挑战。

参考文献：略

　　原文请参考：Teresa Kwok, Mike Zhou, Anna Schaefer. Fractionation and online mass spectrometry based on imaged capillary isoelectric focusing (icIEF) for characterizing charge heterogeneity of therapeutic antibody. Anal. Methods,2023,15,411