液相色谱常见21个问与答

1. 在不能确定用什么色谱柱合适时, 应该先试用哪种柱子?

答：一般来说先试用 C-18 或 ODS 柱(ODS 就是 C18 的意思)。C18 柱适用范围广，容易得到良好的分析和分离结果。而且 C18 柱稳定性好，使用寿命长，性价比高。

2. HPLC 系统的基本构成是什么?

答: 能正常工作的 HPLC 系统必须包括: 进样器、泵、检测器、和数据处理器(电脑和软件)。要想得到更好的分析结果，还可以再加上脱气机和柱温箱。

HPLC 系统的配置方法基本上分两种：一是将所有的配件整合在一起，另一种是模块化设计，各个配件模块可以随意组合。

（LUMTECH制备液相）

（ECO plus GPC）

3. HPLC 的品牌和型号众多, 哪一种最适合我呢?

答：虽然仪器指标和价格很重要，但它们并不是唯一的决定因素。许多 HPLC 的使用者觉得这些指标的意义很难理解；有的销售人员给出的指标甚至具有误导性。因此，您还可以参考考虑以下几个因素:

1) 真正仪器用户的意见；

2) 亲手试用仪器或参加仪器实际演示；

3) 经销商的售后服务能力；

4) 仪器维护费用；

5) 将来仪器能否升级。

4. 进样器有哪些重要指标?

答：进样器的重要指标包括：重复进样的重现性、进样范围以及线性进样范围、和交叉污染。当您只想用 1~2 个标准溶液制作标准曲线时，或者样品的浓度范围很大时，进样器的线性范围就显得尤其重要。进样交叉污染对痕量分析结果的可靠性至关重要；有时侯甚至需要在每一次进样前后，都运行复杂的清洗程序以克服交叉污染。

手动进样阀和自动进样器

5. 高压梯度泵和低压梯度泵有何不同?

答: 在低压梯度泵系统中，不同的流动相先经过混合阀混合后才进入泵头。低压梯度泵系统比较经济，因为它只有一个泵头。您可以使用多种流动相，成本不会太高。

在高压梯度泵系统中，不同的流动相由不同的泵头输送，然后在泵出口处混合。它提供了比低压梯度泵快得多的梯度, 这是因为溶剂的混合点非常接近柱头的缘故。

梯度反应的快慢可以用滞后体积来衡量。高压梯度泵的滞后体积在 50-300 微升之间，而低压梯度泵的滞后体积可以是前者的 2~3 倍。当分析时间短或者流速很低时，一个小的滞后体积是非常重要的。如果滞后体积太大，就无法得到重现性好的淋洗梯度；因为设定的梯度尚未到达柱头前，分析运行已经完成。

（Calmflow plus4.1S高压泵）

（Calmflow plus 6.1L四元泵）

6. 恒流(Isocratic)泵有哪些重要指标?

答: 恒流泵的指标包括: 最大工作压力、流速范围、流速的重现性和准确度、压力波动、压力监测与过压停机。

（体积很小的恒压泵）

7. 梯度泵有哪些重要指标?

答: 梯度泵的指标包括: 最大工作压力、流速范围、流速的重现性和准确度、梯度的重现性和准确度、滞后体积、压力波动、压力监测与过压停机。

8. 在线脱气机是必须的吗?

答: 永久气体在不同的溶剂中溶解度不同。当不同的溶剂在线混合时，溶解于原溶剂中的气体会因在混合溶剂中的溶解度不同而释放出来。作为证明, 您可以做一个小实验：加一些水到甲醇中— 您会看到许多气泡冒出来了。如果 HPLC 使用的是低压梯度泵, 这些气泡会影响泵头的工作和使基线噪音增大,并且导致保留时间的改变。因此在线脱气机是必须的。对于高压梯度泵来说, 因为液体的混和是在经过泵之后，气泡的影响要小一些。如果条件允许，还是建议使用在线脱气, 有助于降低基线噪音。

如果使用的是恒流泵，脱气机就不是那么必须了。因为在真空过滤溶剂时，已经将大部分的气泡除去。

9. HPLC 检测器有哪几种?

答: 现有的检测器有： UV 检测器、荧光检测器、电化学检测器(包括极谱、库仑、和安培检测器等)、电导检测器、示差折射率检测器、蒸发光散射检测器、手性检测器、放射性同位素检测器和质谱检测器。

10. 如何选择合适的 HPLC 检测器?

答：检测器的选择要依据分析的对象和目的来确定。包括分析物的类型与含量、检测的灵敏度和选择性、是否需要化合物分子结构的信息等。

UV 检测器是性能最可靠和应用最广的检测器。如果分析物在 200 纳米以上有吸收，UV 检测器可谓最佳之选。而对于某些大的芳环类化合物 (如多环芳烃)，选用荧光检测器可能将检测灵敏度提高 10~100 倍。

电化学检测器用于易发生电化学氧化还原反应的化合物：例如酚类、芳香胺类、和一些碳水化合物。因为选择性强，所以对上述化合物的检测灵敏度要高于UV 检测器。但是, 由于电极与柱流出液直接接触并与其中的化合物发生反应,其电化学响应可能不如 UV 检测器那样稳定。

电导检测器也是一种电化学检测器, 它是离子色谱常用的检测器; 主要用于测定无机阴阳离子, 和部分极性有机物 (如一些羧酸) 等。

示差折射率检测器可检测任何一种化合物, 但是它的灵敏度要比 UV 检测器低100 -1000 倍。它的另一个应用限制是不能进行梯度淋洗。因此, 示差检测器主要用于弱紫外吸收的有机化合物; 例如小分子有机酸、碳水化合物、和一些聚合物的检测。

蒸发光散射检测器的应用范围与示差检测器相近, 但它可以用于梯度淋洗。它的主要限制因素是需要使用大量的氮气来蒸发掉流动相。

质谱检测器的应用越来越广泛, 尽管它的价格比其它种类的检测器高 10~20 倍。它是一种兼具高特异性和高灵敏度的通用型检测器。与传统检测器相比, 它在定性和定量方面都有很大的优点。它不仅能够给出普通色谱图, 而且可以提供化合物的分子结构信息。

11. 如何选择紫外检测器的流通池?

答: 如果流通池过大, 两个相邻的峰有可能在流通池中混合在一起; 如果流通池太小, 到达光检测元件的光太少而可能使噪音过高。较高的柱前压也会限制流速的范围从而影响流通池的选择。

我们可以根据信号峰的大小来选择流通池。 如果峰型狭窄, 需要的流通池就小。一般来说, 流通池的体积应该不大于峰体积的 1/3。譬如在峰宽是 0.1 分钟时的流通池体积：如果流速为 1 毫升/分钟, 则不应该大于 33 微升; 如果流速为0.01 毫升/分钟则约为 0.3 微升。

12. 如何选择相似的 C18 柱? 

答: 不同厂家提供的 C18 柱或 ODS 柱的 HPLC 谱图差别可能相当大; 其原因是所用硅胶的性质、碳覆盖率和表面积等差别都很大。如果要想在同样的条件下得到相同的谱图, 就要用同一厂家的产品。如果想要试用性质类似的 C18 柱, 可以选择硅胶的性质、碳覆盖率和表面积都很接近的柱子。

13. 怎样选择保护柱?

答: 保护柱的体积应该小于分析柱的十分之一; 柱内填料也要与分析柱类似。如果做不到, 可以选择保留能力比分析柱弱一些的保护柱。

14. 色谱柱的重要指标有哪些?

答: 这些指标包括: 柱效、惰性、重现性、耐用性和 pH 范围, 以及不同批次的色谱柱之间分析结果的重现性。

15. 怎样选择手性柱?

答: 一对手性分子能否被某一手性柱分开是很难说的。因此, 最好的方法就是查找文献看有无现成的方法, 或者将样品送到手性柱厂家做试分离。

16. 封尾型反相色谱柱有什么优越性?

答: 当硅胶表面键合了 C18 或者 C8 等基团后, 硅胶表面仍然有残存的硅羟基(SiOH)。这些硅羟基可能同离子型的化合物发生二级反应, 导致峰型不对称或者拖尾。特别是当流动相中含有金属离子, 或者是在分析分离碱性化合物的情况下,二级反应尤为严重。当用小分子硅烷将裸露的硅羟基键合封尾后, 二级反应即被大大降低。但是, 封端基团在酸性的条件下容易水解; 因此, 封尾柱不宜在 pH<3的情况下使用。

17. 怎样延长色谱柱的使用寿命?

答: 流动相和样品应事先过滤; 确认流动相的 pH 范围在色谱柱的规定工作范围之内。如果色谱柱有一段时间闲置不用, 应该用甲醇或乙腈做最后清洗。

（LUMTECH最新轴向加压制备色谱柱，通过可调整柱端的螺丝进行轴向调整，可以再调整柱床长度的30%（25-40mm），保证制备柱性能不变，延长使用寿命。）

18. 在反相液相色谱中, 为什么乙腈和甲醇是最常用的流动相?

答：因为乙腈和甲醇可以和水以任意比例混合。而且在紫外测定范围内，乙腈的透明度很高；甲醇虽然有吸收，但它是常用的样品溶剂流动相和溶剂一致时可以减少背景的吸收。此外，它们也容易得到。

19. 用乙腈和甲醇做流动相有何不同? 

答: 乙腈在近紫外区(200~210 纳米)几乎没有吸收; 如果分析物(如小分子有机酸)在这一波长段有吸收的话, 乙腈将是最佳的选择。乙腈也非常适用于高流速或柱子部分堵塞时的情形, 因为用乙腈时的柱压比用甲醇时低的多。甲醇最大的优势是价格低廉; 而且它比乙腈稳定。当乙腈长时间暴露于常见光下时, 有可能形成聚合物并堵塞 HPLC 的阀和过滤头。因此, 乙腈最好盛放于棕色的玻璃中。

20. 正相 HPLC 和反相 HPLC 有何不同?

答: 在反相 HPLC 系统中, 流动相是极性的, 色谱柱填料则是非极性的。所以, 极性强的化合物比极性弱的先被冲洗出色谱柱。而正相 HPLC 的情况则完全相反— 色谱柱填料是极性的, 而流动相是低极性的; 弱极性的的化合物较快被洗出。

目前应用最多的是反相 HPLC, 因为它的应用范围广, 结果重现性好, 溶剂也容易处理。而正相 HPLC 的保留时间易改变, 这是由于水分被硅胶填料慢慢吸附所造成的。正相 HPLC 难以做梯度洗脱。但是, 正相 HPLC 在异构体和弱极性化合物的分离上效果不错, 而这正是反相 HPLC 的弱项。

21. 哪一种参数能最好的反映工作中的 HPLC 的仪器状态?

答: 泵压。它反映了色谱柱和整个 HPLC 系统的状况。压力过低(譬如<10 巴)表明有漏液现象; 压力过高说明柱子或者管路堵塞。压力波动大(例如从 10 巴到>50 巴), 可能是泵入口处堵塞, 系统内有气泡, 或者进样阀出了故障。要养成随时注意泵压的好习惯。

作者:加拿大博朗科技 万海滨

万海滨, 博士,从事色谱分析的技术支持多年，以上是对于常见问题的一个总结。希望对从事色谱分析的同仁能有所帮助。如果您的问题在这里没有答案，可以给我们发个邮件marketing@lumtech.com.cn。我们会尽力为您解答。

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