实验室SAXS仪器对HAS蛋白进行SEC-SAXS联用

小角X-射线散射广泛应用于结构生物学来确定蛋白质的尺寸和形状。溶液中的生物大分子可以以多种构象存在，并且一般具有很强的团聚倾向，在没有预先纯化的情况下，对此类分子的数据解释有时会很繁琐。

分子排阻凝胶色谱 (SEC) 能够根据分子的大小进行分离。SEC 与SAXS 联用可以显著提高数据质量，从而提高数据解释的准确性。

小角X-射线散射 (SAXS) 是生物化学等大分子样品研究中常用的方法。在过去的几年里，由于光束传输（第3代和第4代同步加速器、现代实验室X-射线源）、探测技术和数据解析方面的进步，SAXS 测量取得了显著的增长。

在现代同步加速器设备中，分子排阻凝胶色谱 (SEC) 是在SAXS线站上建立的一种制备方法。尺寸不同的分子混合物（如单体、二聚体等）经过SEC纯化，可以得到单分散组分。其基本原理是不同尺寸的大分子在多孔色谱树脂上的停留时间不同。因此，大分子比小分子的洗脱速度快，使得按大小将单个的馏分分开。SEC实验通常是通过紫外吸收测量来确定哪个时间哪个组分被洗脱。

实验室仪器的最新进展（如基于液态金属靶材或高功率的封闭靶等高性能SAXS仪器）使得这种方法也可以适用于实验室设备，为研究和常规测量提供了更多的可能性。

这里我们所示的SEC-SAXS 联合实验是在安东帕的SAXSpace仪器上对HSA蛋白样品进行的，以说明在实验室仪器上进行测量的潜力。

使用标准的FPLC系统和安东帕SAXSpace仪器搭建在线SEC–SAXS 。由于在线测量的性质，样品的特定组分从SEC柱中洗脱时直接测量。

利用现代实验室SAXS仪器的高通量，可以在短时间内获得足够好信噪比的蛋白质散射数据。

图 1: SEC-SAXS 装置所示 SAXSpace 仪器 (前)

和 GE Äkta Pure 25 (后)

通过将人血清白蛋白HSA溶解到缓冲溶液中，制备了人血清白蛋白样品溶夜。所使用的缓冲溶液 (pH 7.5) 组分为20 mM 三（三（羟甲基）氨基甲烷）、150 mMol NaCl和3 % 的甘油。最终HSA浓度为20 mg/mL。

样品在注射到SEC柱之前没有经过进一步的纯化。使用GE Äkta Pure 25 FPLC仪器进行了分子排阻色谱分析。表1总结了SEC实验详细设置参数。

表 1: SEC 测量的实验设置

SAXSpace 仪器的FlowCell中的管子可直接连接到Äkta Pure 25 SEC 仪器UV 传感器的出口，以尽量减小管子长度。

样品已注射到SEC柱上，没有进一步净化。对于SEC运行，得到图2所示的色谱图。单体的信号（尖锐强峰）和低聚物的信号（主信号前的小峰）可以清楚地识别出来。

图 2: HAS蛋白样品的SEC色谱图。 单体峰位由灰色虚线表示。单体洗脱前的峰对应不同的低聚物

SAXS测试是使用安东帕SAXSpace仪器进行的。表2总结使用的实验参数。

表 2: HAS蛋白SEC-SAXS测试的实验设置

对单体蛋白质分子的原始散射数据进行进一步的分析。确定了单体洗脱峰的散射曲线，并取其平均值。总共得到了这个区域内具有恒定散射曲线的10帧数据。然后使用 SAXSanalysis 软件对这10帧数据进行平均并进行背景扣除（图 3a）

即使在总共只有100 s的极短曝光时间内，也能获得极好的数据质量。这允许使用SAXSanalysis 对散射曲线进行Guinier外推来计算回转半径（Rg）。

Rg值为2.8 nm，这与文献值吻合较好。

为了获得实空间结构的信息，利用GIFT软件对散射曲线进行了傅里叶变换。图 3b所示的是对距离分布函数（pddf）结果，显示的是dmax约为10.4 nm的典型单分散蛋白结构的pddf。

图3：（a）实验测试散射曲线与GIFT软件拟合曲线吻合

（b）GIFT软件的IFT计算的对距离分布函数PDDF曲线

在实验室仪器如安东帕SAXSpace和SAXSpoint等仪器上使用在线SEC-SAXS大大提高了在自己实验室进行蛋白质分析的可能性。

即使是具有很强团聚倾向的蛋白质也很容易被测定，因为分离和测定之间没有延迟。由于测量可以在停止流动模式下，因此也可以测量高度稀释低聚物和弱散射小分子。

这进一步减少了同步加速器测量的需求，减少了旅行时间和敏感样品的运输。

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