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徕卡课堂丨专业化设备 —— 比率成像之所需


徕卡课堂,专业化设备,比率成像

作者:Thomas Veitinger 博士

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比率成像技术被广泛用于研究高动态细胞内的离子、电压以及 pH 变化,但这项技术最普遍的应用领域却是钙成像。除此之外,比率成像技术还被用于研究细胞信号通路,比如,钙离子在同种细胞或不同细胞类型之间传递并形成浓度梯度,从而改变细胞的离子浓度、电压或 pH 值。同时,比率成像技术对 FRET 检测也大有裨益,它能够极大的改善所获取图像的信噪比。




*比率成像技术的典型应用领域

比率成像被广泛用于研究高动态细胞内离子、电压或 pH 的变化。但这项技术最普遍的应用领域却是钙成像。钙离子是最重要的第二信使之一,受到众多研究人员的特别关注,它能够调节各种不同的细胞功能,例如,突触传递(胞吐)、肌肉收缩、细胞凋亡,并可作为很多酶类的辅助因子。钙离子可在高度特异性、高度动态性以及偶尔空间受限的方式下,发挥这些功能。细胞内钙浓度的微小变化会对细胞状态产生深远影响。因此,细胞生物学家对测定绝对钙浓度(通常为离子浓度)有着浓厚的兴趣。此外,还应注意的是,在细胞中很多离子、电压或 pH 值的变化并不是一致的,它们在不同的细胞区室中起着不同的作用。在上述研究中,细胞中不同部位的绝对或相对钙离子浓度受到研究人员的广泛关注。在一个细胞中,不同形态区域的钙浓度仅可通过比率成像技术进行可靠比对。比率成像技术还被用于研究各种细胞信号通路,其中,钙离子在同种细胞或不同细胞类型间传递形成的相对钙浓度梯度可以动态地改变离子、电压或 pH 值。要了解细胞信号通路,就必须了解离子、电压或 pH 值的绝对和相对变化。再次强调,只有通过比率成像技术,方可获取可靠的定量和参考结果。除此之外,比率成像技术对 FRET 检测也大有裨益,它能够极大改善所获取图像的信噪比。


*特定荧光基团是比率成像技术的关键所在

要完成比率成像,必须满足与成像设备相关的几个前提条件。首先,必须选择适当的荧光基团或荧光基团组合,这些可以是合成染料或蛋白质结构。本文详细描述了几种用于比率成像的染料,这些染料可因离子结合、电压改变或 pH 变化而出现发射位移的现象。检测上述位移有两种方式:其一,由两个独立波长的光交替激发双激发染料,并在单一波长处检测发射位移(例如,fura-2,图 1a)。第二,由单一波长的光激发染料,并在两个独立的波长处检测发射位移(例如,indo-1,图 1b)。原则上,还可以在细胞内同时载入两种不同的荧光染料,这时出现光强变化而非发射位移(例如,fluo-3 和 fura red,图 1c)。本文还介绍了将对离子、电压或 pH 不敏感的荧光基团共同载入细胞的现象,上述荧光基团可充当参考染料。组合染料的优势是可以使用激发波长较长的染料。这种染料对细胞的损伤要比使用受紫外光或近紫外光激发的比率染料对细胞造成的损伤更小(例如,Fura-2),因为波长可见的光,其光毒性较小。而这种方法的缺点在于,必须将两种染料都载入细胞内。但是,组合荧光基团要具有相似的发射或激发波长,这一点是非常重要的。最后,很多专门用于 FRET 检测的蛋白结构也适用于比率成像。

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图 1:部分钙敏感型染料或染料组合的光谱。(A) 在 510 nm 处的 fura-2 发射染料适用于不同的激发波长(通常用波长为 340 nm 和 380 nm 的光进行双重激发)。依据钙浓度,在 340 nm 波长处荧光强度将增加,并在 380 nm 降低。(B) 利用 338 nm 激发的 indo-1 发射光谱。发射强度将在 400 nm 波长处增加,并在 500 nm 波长处降低。(C) 在 488 nm 波长处激发的 fluo-3 和 fura red 组合。fluo-3 强度将在 520 nm 波长处增加,而 fura red 强度将在 660 nm 处降低,从而实现比率成像。(D) 在 488 nm 波长处激发的非比率染料 calcium green 的发射光谱。在 510 nm 波长处的光强将因钙结合而增加。在这种情况下,无法实现比率成像。图片来源:Molecular Probes® 公司手册——在线版本。


*化学染料、染料组合和蛋白质结构


下面是部分满足比率成像的化学染料、染料组合以及蛋白质结构的列表:

 

 

表1:适用于比率钙成像的荧光基团/荧光基团组合

 

 

 

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表2:适用于比率离子成像的荧光基团

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表3:适用于比率 pH 成像的荧光基团

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表4:适用于比率电压成像的荧光基团

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表 1-4 中的所有激发和发射波长均为近似值。表中所示的 Kd 值不尽相同,这主要取决于(体外/原位,缓冲溶液)实验条件以及与其他离子发生串色现象还有其自身相应的浓度。有关详细光谱和 Kd 值,请查看Molecular Probes® 公司手册 —— 第 11版。


*专业化设备是比率成像的前提条件


要实现比率成像,计算比率所需的两个灰度图像采集间隔时间必须尽量短。为满足上述要求,必须实现激发或检测波长的快速切换、保持短暂激发持续时间以及快速图像获取。为尽可能缩短激发持续时间,建议采用能高效发射激发波长的大功率光源(例如,大功率直流灯 (>200 W)、激光)和光学器件,以满足所需波长的条件。采用快速荧光滤块转盘与强光源可实现激发/发射波长之间的快速切换,仅需数毫秒即可实现激发/发射波长之间的切换。此外,单色光镜或激光与 AOTF(声光可调谐滤色器)配合使用,可实现激发波长之间的快速切换。最后一个重点是,一台功能良好的照相机(可以是EM-CCD)兼具了合理的分辨率以及高灵敏度的优势,可快速获取图像,这是最新比率成像实验的前提条件。比率成像技术本身具备的高帧速率就是一项显著优势,因为很多研究过程都具有高度动态性,并且条件可在数秒内变化。

 


*影响受测荧光光强的因素


荧光基团浓度

细胞内的荧光基团浓度对发射的荧光光强会造成较大影响。可以很容易想到,细胞内的荧光基团越多,发射的光就越多。不幸的是,实验中很难控制细胞内的荧光基团浓度。合成染料(例如,Fura-2)的穿透细胞膜的能力会受到细胞外侧的荧光基团浓度以及孵化时间的影响。但是,最终到达细胞内的染料数量很大程度上取决于制备类型(例如,切片)、细胞类型或细胞系。一般情况下,在组织切片中,染料渗入细胞的效果要比细胞系、原始培养物或分离的单细胞中差一些。此外,不同细胞中的染料数目也不尽相同(取决于细胞健康状态、代谢状况等)。使用蛋白荧光基团取代合成染料时,胞质溶胶中的荧光基团数量取决于转录/翻译速率以及蛋白质转换。通过使用特殊的启动子(插入特定DNA 或氨基酸序列来得到),可以控制蛋白质的转录和翻译速率。但这只能为实验者带来有限的控制效果,因为合成蛋白质的实际速率取决于很多因素(例如,细胞的健康状态、细胞龄以及细胞类型)。再次强调,即使在同个细胞系或一个单细胞内,转录/翻译速率、转运速率以及蛋白质转换速率也可能不尽相同。基于上述因素,我们无法估算一个细胞或部分细胞中的实际荧光基团数量。

样本直径

常规荧光成像的另一个问题是,z 轴中的样本直径 (d) 存在差异。样本直径的范围很广,从几纳米(部分单一细胞,例如,树突、轴突、精子鞭毛)到几微米(单层细胞、单一细胞体质)再到几百微米(例如,棒状切片)。在荧光成像技术中,光路中的所有染料均受到激发和检测(例外情况:共聚焦显微成像,TIRF),导致样本较厚部分的荧光光强大大高于其他部分的荧光光强。这很容易产生误释,因为较薄结构可能不如细胞其他部分那样“亮”,但实际上其离子(例如,钙)浓度却比其它部位高很多。尽管如此,这些部分的亮度看起来仍大大低于光路中相应的荧光基团数量,因此,检测到的光强较低。

光学常数

最后一个重点是,不同样本(细胞类型;切片、细胞培养物、单一细胞等)中的光学常数 (K) 以及成像设备各有不同。不同的细胞类型拥有不同的折射率和透光率,这主要取决于这些细胞的形态。在设备方面,不同的制造商提供的光学部件,例如,二向色镜、滤光片、物镜等,也分别具备不同的透光率。此外,不同的光源具备不同的光发射强度(例如,激光、氙弧灯、汞弧灯),其会对荧光基团激发效率产生较大影响,并因此影响由荧光基团发射出来的光数量。最后,在发射光的检测方面,也表现出巨大不同,这取决于所用的常规 CCD 照相机、EM-CCD 照相机或光电倍增管等。此外,不同制造商以及相同制造商提供的不同产品类型在光子灵敏度方面也存在着显著差异。还有一点值得注意,即使同一制造商生产的相同产品类型,例如,物镜或照相机等,也存在着差异。所有这些条件都使得每个单一成像设备存在轻微差别,而每个单一成像设备也具有其自身的光学常数(K)。这再次验证了上述观点,即无法通过简单测量光强估算出细胞中钙离子等的数量。


作者简介:

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Thomas博士毕业于德国波鸿鲁尔大学,主攻生物学,并获得发育神经生物学博士学位。在一篇博士论文中,他研究人精子中由气味驱动的亚细胞钙动态变化,在活细胞成像方法和生理学方面积累丰富经验。作为博士后,他曾在德国亚琛大学化学系工作。在那里,他使用膜片钳技术和活细胞成像来研究雄性干细胞。自2011年5月起,他作为产品经理加入徕卡显微系统,主要负责活细胞成像,电生理和神经科学方面的应用。


 


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