用户动态|高速精确实现在体诊断——新型双色受激拉曼散射成像技术

供稿 | 李一鸣

校对 | 贺若愚

在外科手术中，对肿瘤边界进行快速病理成像被认为是精准切除的关键。受激拉曼散射（SRS）成像作为一种无须标记的新型显微术，避免了传统染色处理对组织的破坏，从而有望实现在体诊断。与单色SRS相比，双色SRS由于利用组织中两种成分的化学衬度叠加成像，从而可获得与H&E标准染色类似的诊断结果。然而，当前双色SRS较低的成像速度严重制约了其在实时组织学成像中的应用。

基于以上背景，复旦大学应用表面物理国家重点实验室的季敏标教授等人对双色SRS显微镜光路进行了重新设计，开发出了一种速度显著提高的光路装置，并成功实现了多种组织的实时成像。

图1. (a) 双色SRS显微镜的光路设计图；(b) 光谱聚焦装置中泵浦光（蓝色）和两束斯托克斯光（橙色）的时间分布示意图；(c) 调制后两束斯托克斯光脉冲（S1和S2）的相位差异。

在课题组设计的光路图中，基于飞秒光谱聚焦的受激拉曼成像方法，通过延时线DL1改变泵浦与斯托克斯脉冲的时间间隔以实现两种拉曼频率（Ω1和Ω2）的选择，通过延时线DL2调节S1与S2的时间间隔以调节二者的调制相位差为π/2，由此使泵浦光的两通道受激拉曼损失（SRL）信号分别被锁相放大器的同相（X）和正交（Y）通道同时探测，从而实现双色同步成像。实验中自发拉曼光谱的采集采用了HORIBA iHR320光谱仪与液氮制冷Symphony CCD，拉曼数据分析采用了LabSpec软件。

图2. 串行和并行双色SRS成像的运动伪影研究。(a)和(b)分别为仅采用S1，通过顺序调节DL1的延时进行两种拉曼频率（2848 cm-1和2926 cm-1）的串行成像策略（灰线）及对应成像图；(c)和(d)分别为本研究对两种拉曼频率（2848 cm-1和2926 cm-1）的并行成像策略（灰线）及对应成像图。

对该成像装置，作者通过实验验证了两束斯托克斯光束间对于拉曼频移相差约35cm-1以上的双色成像时，不存在干涉问题，锁相放大器的X和Y通道信号的串扰也可以忽略，显示出成像的极高分辨率。

另外与之前的双色成像通常采用串行成像，即对两种组分进行顺序成像必定造成组织活动的伪像相比，该研究光路的并行特性赋予的同步特征杜绝了该类伪像，则显示出动态成像的极高精确性。

更进一步地，该研究光路中的双通道同步探测还大大节约了顺序成像时波长调谐所耗费的时间，即成像速度大幅提升。作者通过对小鼠脑冠状切片的双色成像实验表明该装置的成像时间较之前的串行成像装置减少了50%以上。

图3. 活体生物的在体双色SRS显微图像。(a)和(b)分别为斑马鱼胚胎的心脏和大鼠耳朵的透过模式图像，其中红色和青色区域分别代表血红素和蛋白质；(c)为大鼠耳下60 μm深度处皮下脂肪细胞的反射模式图像，其中绿色和蓝色区域分别代表脂类和蛋白质；(d)为反射模式图像的信号串扰随成像深度增加的强度变化。

在本研究中，作者成功采用透过和背向散射两种模式进行了不同活体生物的在体成像实验。包括对斑马鱼跳动的心脏和小鼠毛细血管中流动的血细胞的实时双色成像。特别对背向散射模式，通过添加背向散射光电探测器，使该光学装置可实现对组织的不同深度成像，且信号串扰在深度增加过程中始终小于4%，从而显示出其在外科手术过程中进行实时成像与诊断的极大潜力。

此项研究工作得到了国家重点研发计划“数字诊疗装备”专项、上海市青年科技启明星计划、上海市科技创新行动计划以及国家自然科学基金面上项目等的基金支持；

相关成果近期以封面文章发表在美国光学学会的旗舰杂志《Optica》上：Ruoyu He, Yongkui Xu, Lili Zhang, Shenghong Ma, Xu Wang, Dan Ye, Minbiao Ji, “Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging”. Optica 2017, 4 (1), 44-47.

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HORIBA科学仪器事业部

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