启动子活性检测

双萤光素酶报告基因检测（启动子活性）实验

摘要：通过双萤光素酶报告基因系统检测转录因子steroidogenic factor-1（SF-1）能否与Oct-4启动子片段 (4kb) 发生作用。实验结果显示二者存在调控关系。
关键词：steroidogenic factor-1（SF-1），Oct-4 promoter，transcription factors，Dual-Reporter Assay

一、 实验原理
转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式因子，转录因子的DNA结合域和顺式因子实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。萤光素酶报告基因实验（luciferase Assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段，其原理简述如下：（1）用靶启动子的特定片段替换报告基因质粒（如pGL3-basic）的启动子区。（2） 将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转。如果该转录因子能够激活靶启动子，则萤光素酶就会表达，且其表达量与转录因子的作用强度成正比。（3） 加入特定的底物，萤光素酶与底物反应，产生萤光素，检测荧光的强度可以对萤光素酶的活性定量，进而判断该转录因子能否与靶启动子片段发生作用 （及其作用强度）。

二、 实验目的
验证转录因子SF-1能否与Oct-4启动子片段发生作用。

三、 实验步骤
1. 质粒转染细胞：
1) 细胞铺板：将细胞按70%的汇合度接种到96孔板。
2) 转染：16h后转染萤光素酶报告基因质粒和RNA，每个样品设置6个复孔。
a) 配制DNA和转染试剂: 96孔板转染质粒时每孔比例为pLenti：Firefly：Renilla：转染试剂=0.2μg：0.1μg：0.01μg：0.25μl。
b) 稀释好DNA及转染试剂，常温孵育5min。
c) 将稀释好的DNA分别和转染试剂混匀，常温孵育20min。
d) 每孔弃去15μl培养基，将15μl DNA转染混合液添加到每孔细胞样品中。
e) 转染6h后，换新鲜完全培养基。
2. 双报告基因检测：
a) 质粒共转染48h后，弃去培养基，用100μl 1XPBS洗1遍。
b) 倾斜96孔板，吸干剩余的PBS。
c) 去离子水将5XPLB稀释成1XPLB，使用前放到常温。
d) 每孔加50μl稀释好的 1X PLB，摇床常温条件下摇15min，进行裂解。
e) 白色不透光的96孔酶标板中每孔加步骤4的上清液10μl，加入100μl预先混好的LAR II，2s后测数据。
f) 每孔添加100μl预先混好的Stop&Glo Reagent，静止2s后，测数据。
注意：进行Luciferase活性检测时，需在避光条件下进行。

四、 实验结果

表1. 空白校准后的数据：

Firefly luciferase的数据除以Renialla luciferase的数据，用平均值做图。
p值的计算方法为双侧student-T-test。P值判断两组数据的差异是否显著。

图1.SF-1调控Oct-4启动子区
***表示p<0.001
结论：从图1的结果可以看到，在SF-1过表达的情况下，Oct-4启动子活性相对对照组明显升高（p<0.001）。

五、 参考文献
1. Yang HM, Do HJ, Kim DK, Park JK, Chang WK, Chung HM, Choi SY, Kim JH.Transcriptional regulation of human Oct-4 by steroidogenic factor-1.J Cell Biochem. 2007;101(5):1198-1209.
2. Lorenz WW, McCann RO, Longiaru M, Cormier MJ.Isolation and expression of a cDNA encoding Renilla reniformis luciferase.Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 May 15;88(10):4438-42.
3. Farr A, Roman A. pitfall of using a second plasmid to determine transfection efficiency.Nucleic Acids Res. 1992 Feb 25;20(4):920.
4. Sherf, B.A. et al. Dual-Luciferase® reporter assay: An advanced co-reporter technology integrating firefly and Renilla luciferase assays. 1996 Promega Notes 57, 2-9.

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