PCR 扩增必看：让你的「引物设计」少走弯路

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称 PCR）是一种体外快速扩增特定基因或 DNA 序列的方法。由美国科学家 PE Cetus 公司遗传部的 Dr. Mullis 发明并获得了 1993 年化学诺贝尔奖。

PCR 技术目前是分子生物学研究中使用最多、最广泛的手段之一，而引物设计是 PCR 技术中至关重要的一环。使用不适合的 PCR 引物容易导致实验失败，比如表现为特异性差，扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），无条带或条带弱，等等。

PCR 引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板 DNA 序列。因此，引物的优劣直接关系到 PCR 的特异性与成功与否。

现在 PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到某指定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。一般来说，专门进行 PCR 引物设计的专业软件功能更为强大，但使用起来却不太容易。

引物的设计可以参考一下 10 条设计原则：

1、引物与非特异扩增序列的同源性不要超过 70% 或有连续 8 个互补碱基同源；
2、某些引物无效的主要原因是引物重复区 DNA 二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计 mRNA 的稳定二级结构，有助于选择模板；
3、寡核苷酸引物长度为 15～30bp，一般为 20～27bp，引物的有效长度>38 时，最适延伸温度会超过 Taq DNA 聚合酶的最适温度（74℃)，不能保证产物的特异性；
4、G+C 含量一般为 40%～60%。其 Tm 值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50% 寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于 Tm 值 5～10℃；
5、引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其 3′端不应超过 3 个连续的 G 或 C，因这样会使引物在 G+C 富集序列区错误引发；
6、引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合；
7、两引物之间不应不互补性，尤应避免 3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于 4 个连续碱基的同源性或互补性；
8、引物的延伸是从 3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的 PCR（AS-PCR）反应中，引物 3′端不能发生错配；
9、引物的 5′端限定着 PCR 产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性；
10、密码子的简并：如扩增编码区域，引物 3′端不要终止于密码子的第 3 位，因密码子的第 3 位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。

PCR 仪的选择也至关重要，要考虑到仪器的升降温速度，控温的准确性及均一性等因素，只有仪器可靠，实验结果才可信。TurboCycler 梯度核酸扩增（PCR）仪是台湾 Blue-Ray 研发的一款 PCR 仪，采用先进的半导体技术保障完美的升降温表现，12 探头温度校正系统进行温度校正，确保高标准的温度准确性和均一性，高达 5.5℃/sec 的升温速率，极佳的准确性和一致性。还可以设置一系列不同的温度梯度。高清晰、高灵敏的电容式触摸屏，让您戴着手套也可方便操作，图形化界面，简洁明了。有可选 Wi-Fi 模块，搭配手机远程监看试验状态，即时掌握实验进度。TurboCycler 梯度核酸扩增（PCR）仪控温准确操作方便，是一个不错的选择。

PCR 产物的质控也是不可或缺的部分，关乎到后续实验的正常运行。传统的凝胶电泳存在很多人为弊端，目前市面上多使用全自动毛细管电泳仪如 Qsep100 或 Qsep1 检测，该系列仪器检测灵敏度高，分辨率高，在 500bp 以内最佳分辨率可达 1-4bp。无需制胶、染色、加样、拍照等步骤，也不需荧光标记，只需将待检测样本放于仪器样品盘，全自动上样电泳出结果。1-96 或 1-8 个样本灵活上样，数据分析简便灵活。可节约科研工作者的时间，提高科研工作者的实验效率，更避免了科研工作者与核酸染料的接触，提供更为方便快捷的科研服务。