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利用质谱流式技术深层次研究耗竭的 T 细胞

发布时间: 2020-07-15 13:41 来源:深圳市恩科生物科技有限公司

质谱流式技术(CyTOF)在免疫学研究方向中,是单细胞蛋白表达层面进行深度分析的重要技术。对单个细胞进行多达 40+ Marker 的检测,对于表征特定的细胞类型显得尤其重要,如耗竭的 CD8+T 细胞(TEX)。TEX 具有有限效应器功能,在许多慢性感染和癌症中积累,并且接受数个免疫检查点(如 PD-1)介导的抑制性信号传导。值得注意的是,TEX 代表了免疫刺激疗法目标对象,并被认为是针对 PD-1 免疫疗法的主要相关因素。与规范的功能性 T 细胞亚群相比 [如幼稚 T 细胞(TN)、效应 T 细胞(TEFF)和记忆 T 细胞(TEME)],TEX 在功能、转录组和表观基因组方面存在很大差异。然而,TEX 与 TEFF 和 TMEM 的表型区分往往非常困难,因为 TEX 表达的很多 marker,效应 T 细胞和记忆 T 细胞同样表达。此外,已经描述了 TEX 的显著异质性,如具有祖先-后代关系的 TEX 亚群,或具有不同程度的衰竭或稳态潜力的群体,可能与疾病的进展直接相关。此外,TEX 亚群具有重要的临床意义,因为它们对抗病毒和检查点疗法的反应不同。因此,对 TEX 的精确评估需要一个高参数分析,考虑到与规范 T 细胞群体的差异以及 TEX 亚群的异质性。在这篇综述中,我们讨论了如何通过将耗尽导向的表型分析与功能剖析相结合,用质谱流式技术来揭示人类 TEX 亚群的作用。人类 TEX 亚群的质谱流式分析对于更好地了解 TEX 在慢性感染和癌症中的作用至关重要。在癌症免疫治疗期间进行免疫监测,提高 T 细胞免疫力具有重要意义。
 

简介

质谱流式技术已成为人类免疫细胞研究中的一项变革性技术。利用纯化的金属同位素作为特异性抗体的标签,对单个细胞进行染色,并通过飞行时间质谱对细胞标记的这些同位素标签进行检测,可以分析单个细胞上 40+ 的蛋白 marker。与传统的流式细胞仪相比,质谱流式的主要优势在于不会出现光谱重叠,分辨率很高。在传统的流式细胞仪中,由于需要补偿不同荧光团的重叠发射光谱,试剂的复用经常受到限制。在涉及珍贵样本(患者有限)的临床转化研究中,整合 40 多个检测通道的单细胞免疫图谱分析的能力,对于全面的免疫监测(即分析许多免疫细胞群体)特别有价值。然而,除了这种 " 横向 " 的剖析方法(即分析多个免疫细胞群体),流式细胞技术也适用于深层次的 " 纵向 " 剖析一个给定的免疫细胞群体,在这个群体中揭示以前未知的异质性,如 CD8 + T 细胞内的复杂性。在这篇综述中,我们将讨论通过质谱流式对耗竭的 CD8+T 细胞进行深度免疫剖析,从而对它们的异质性和在慢性感染和疾病的病理生理学中的作用进行了解。在许多旨在增强 T 细胞功能的免疫肿瘤试验中,使用质谱流式检测技术对耗竭的 T 细胞进行表征具有特别重要的意义。
 

T 细胞耗竭:背景信息和主要观点

耗竭的 T 细胞(TEX)越来越多地被认为是一个独特的 T 细胞群体,在许多慢性感染和癌症中发挥关键作用。TEX 最初是在慢性病毒感染中发现的,随后的许多报告强调 TEX 在持续的细菌和寄生虫感染以及癌症和自身免疫中的积累。TEX 的特点是抑制性受体的共表达和 T 细胞抗病毒 / 抗肿瘤功能的降低。靶向抑制性信号传导,如通过干扰抑制性受体 PD-1 信号传导或其他免疫检查点,可以重振 TEX 功能,有助于控制或消除疾病。因此,TEX 最近被确定为接受检查点治疗的患者临床反应的主要相关因素,这突出表明,TEX 作为免疫治疗试验的相关生物标志物,需要进行更好的免疫剖析。

基于 TEX 与效应 T 细胞 (TEFF) 对比,由于抑制性信号传导导致的效应器功能降低,根据 " 功能丧失 " 模型,TEX 长期被认为是一个被抑制的效应 T 细胞群体。然而,近年来,已有研究表明,当信号诱导 T 细胞耗尽后,再将 T 细胞激活,可以驱动这些细胞动态地进入一个独特的分化命运。TEX 的结果与 TEFF 和记忆 T 细胞(TMEM)不同,在代谢组,转录组和表观基因组方面均有巨大变化(图 1)。

图 1. 胸腺后 CD8 + T 细胞分化模型。 根据该模型,在启动过程中激活幼稚 T 细胞(TN)后,早期激活的效应 T 细胞(TEA)接收信号,根据抗原的识别功能分化为效应 T 细胞(TEFF)和记忆 T 细胞(TMEM) ,共刺激和炎症环境。 相比之下,持续的抗原刺激,在共抑制信号存在下降低的共刺激作用以及长时间暴露于炎症线索是向耗竭的 T 细胞(TEX)命运分化的主要驱动力,其中包括抑制受体(IR)的上调。

在急性和慢性病毒感染的淋巴细胞脉络膜脑膜炎病毒(LCMV)模型中,详尽的表征了耗竭的 T 细胞与功能性效应器和记忆 T 细胞的分化。在这些模型中,急性和慢性 LCMV 株之间的遗传差异极小,免疫优势的 T 细胞表位相同,从而有助于在内源性反应水平或通过分析共享相同特异性 T 细胞对 T 细胞表型进行交叉比较。在急性愈性感染的过程中,诱导产生功能性效应 T 细胞后,病毒清除,然后建立记忆 T 细胞库(图 1)。与此形成鲜明对比的是,慢性感染过程中的抗原特异性 T 细胞逐渐发展出衰竭的主要特征,包括上调抑制性受体表达和功能损伤(例如,IL-2,TNF 和 IFN-γ的连续损失)。在慢性感染的第一周,衰竭程序似乎保持灵活并且可以改变(比如将 T 细胞移植到到非慢性感染宿主后),在感染第二周之后,衰竭程序似乎变得更加固定。值得注意的是,即使在免疫检查点封闭和功能恢复后,在转录和表观遗传水平上,TEX 总体分化程序仍保持稳定。
 

评估耗竭的 T 细胞的挑战

通过对慢性感染和癌症中抗原特异性 T 细胞的研究,获得了许多关于 TEX 的了解,并且通过质谱流式技术对表面 marker 和胞内 marker 进行分析,使人们对抗原特异性 T 细胞有了更深刻的了解 。在没有抗原特异性先验知识的情况下,鉴定 TEX 仍然具有挑战性。在人类疾病(尤其是癌症)中进行免疫分型的主要障碍是,许多肿瘤抗原(尤其是新抗原)是未知的,并且评估抗原特异性 T 细胞群的工具有限。此外,已建立的人类 T 细胞分化模型基于诸如 CCR7 / CD62L,CD45RA / CD45RO 或 CD27 / CD28 的标记,这些模型可以评估未成熟的 T 细胞(TN),TEFF 和 TMEM 以及其他亚群(例如中枢和效应记忆 T 细胞)无法可靠地将 TEX 与效应或记忆 T 细胞表型区分开。一个可能的解释是,TEX 与 TEFF 类似,最初经历了 T 细胞活化程序,其中包括幼稚 T 细胞 marker 的下调(例如淋巴结归巢标志物 CCR7 和 CD62L 或与活化程序和记忆程序相关的的 CD45RA 到 CD45RO 剪接)。同时出现激活标志的 marker,例如 CD38。

因此,许多研究人员转向了研究 TEX 中具有重要作用的抑制性受体,例如 PD-1(或与其他抑制性受体(例如 CTLA-4,Tim-3,Lag-3、2B4,CD160)结合使用,TIGIT 等)评估慢性感染和癌症中耗竭的 T 细胞。然而,这些抑制性受体也能被功能性效应 T 细胞表达,也可能存在于记忆 T 细胞群体中,因此缺乏特异性。此外,存在 TEX 的异质性细胞亚群,这对细胞亚群的表型表征提出了进一步的挑战。然而,尽管没有单一的表型标记可以可靠地评估人类的 TEX,结合使用多种抑制受体来分析抗原特异性耗竭的 T 细胞具有实用性。整合多个 TEX 标记的组合策略,可以克服免疫图谱分析的局限性。
 

利用质谱流式技术识别 TEX  的 Marker 选择策略

为了确定用于标记耗竭 T 细胞的合适 marker,可以利用规范 T 细胞群和 LCMV 模型中耗竭 T 细胞出现的转录和表观基因组程序的差异作为特定的候选基因。

通过这种方法,鉴定出了一系列由表观基因组调控的 TEX 特定基因,其中包括 313 个在 TEX 中特异性上调的基因,这些基因通过转录组分析显示了基因表达上调,并且伴随着增强子可及性的变化。此外,鉴定出在 TEX 中被下调的 182 个基因在转录水平上被特异性抑制并且缺乏相邻增强子的可及性。在 LCMV 感染模型中鉴定出的这些耗竭基因被预测为 TEX 的标记。然后,通过比较单个基因在其他鼠类和人类感染和癌症中的富集来验证单个基因,通过这种方法描述 T 细胞衰竭。这些基因在多种衰竭状态下均具有很强的基因表达富集能力,针对这些基因适合使用质谱流式技术进行进一步分析。

TEX 在单细胞或总体水平上的功能评估

功能障碍是耗竭的 T 细胞的关键特征。确实,耗竭(exhaustion)一词最初是用来描述效应子功能的完全丧失和抗原特异性 CD8 + T 细胞应答的消失。与功能性效应 T 细胞和记忆 T 细胞相比,TEX 经常经历效应器功能的逐步丧失,其范围从抗病毒细胞因子产生的轻度损伤到完全缺失。通常,轻度衰竭的细胞表现出 IL-2 产生能力受损,随后在更严重的衰竭中丧失 TNF 的产生能力,而通常情况下 TEX 维持产生 IFN-γ的能力,严重衰竭的情况下部分丧失。研究表明,TEX 中抗凋亡分子(即 Bcl2)的表达降低,促凋亡 Bim 的水平较高,这可能与耗竭严重的细胞中的凋亡前表型有关。此外,TEX 的细胞毒性能力减弱和增殖能力受损,研究人员经常使用细胞周期活性 marker 和增殖 marker 来测量,通过检查点封锁免疫治疗后,TEX 恢复活力的程度。但是,细胞衰竭并不只是影响所有 T 细胞功能的 “功能丧失” 表型。相反,据报道,TEX 对某些趋化因子如 CCL3 和 XCL-1 的诱导作用变高,对其他细胞因子如 IL-10 或 IL-21 的诱导作用更高。

质谱流式在 TEX 功能的全面表征中发挥了积极的作用。例如,结合免疫图谱分析,可以很容易地评估出颗粒酶 K 表达增加,颗粒酶 B 和穿孔素减少的 TEX 细胞毒性能力的差异。在检查点治疗期间,通过 Ki-67 这种细胞周期 marker,结合 TEX 标记物表型进行评估,在 TEX 的质谱流式分析中至关重要。通过表型分析对复杂的与衰竭相关的细胞因子的表达模式,进行无偏差的评估仍然具有挑战性。例如,专注于 T 细胞表达效应细胞因子能力的分析经常难以区分从未表达过这些分子(即没有抗原的 T 细胞)或失去表达(包括 TEX)的细胞。为了应对这些挑战,可以使用针对细胞因子(例如,IFN-γ,TNF,IL-2)的多功能性特征受损,但趋化因子的表达增加(例如,CCL3 / 4,XCL-1)来评估单个 T 细胞。使用功能衰竭的评级,在单细胞水平上评估其功能趋化因子 / 细胞因子的衰竭概况,结合使用质谱流式技术进行的全面的表型衰竭分析,将 TEX 功能整合为单独的 T 细胞衰竭指标,能够可靠地将 TEX 与 TEFF,TN 和 TMEM 区别开来。因此,高维度的功能性和表型性衰竭分析的组合可评估个体 TEX 细胞亚群的有利工具,也能评估慢性疾病中 CD8 + T 细胞免疫功能障碍的普遍程度。
 

使用质谱流式鉴定临床相关的高维 TEX 表型

在质谱流式的 panel 中集成更多的耗竭 marker 会给数据评估带来新的挑战。在传统流式细胞的研究中,几乎没有 TEX 的标志物,数据评估在很大程度上依赖于手动 gating 和对抑制性受体共表达或多功能性的布尔分析(例如,使用 SPICE 软件分析)。这些方法对于质谱流式技术评估 TEX 仍然很有价值,但是相对于质谱流式的生物信息学算法相比,还是存在一些缺点。已经开发了数种生物信息学策略,这些策略可以使用降维方法 [例如 tSNE 的可视化)以及高维数据中的聚类识别策略来对高维数据进行更直观的可视化。 [例如 SPADE,FlowSOM,PhenoGraph 等)或在其他地方进行了回顾的轨迹推断。例如,tSNE 可用于通过基于耗竭 marker 表达计算 TEX 表型的高维复杂度的二维表示来生成 “耗竭图”(图 2)。这种方法有助于鉴定 TEX 异质性,并指出临床环境中的耗竭状况差异(图 2),包括检测富含肿瘤微环境的 TEX 细胞的特定细胞亚群。此外,tSNE 实现(“ OneSense”)将高维耗竭表型减少为单个参数,并将其与其他种类的 marker(例如 “功能”)进行比较。但是,尽管基于 tSNE 的分析具有优势,并且在局部邻域关系方面具有很高的准确性,但 tSNE 在地不同高维区域上执行不同的转换,从而导致在解释 tSNE 地图上的距离关系时可能会遇到挑战。因此,使用 tSNE 很难发现离散的高维簇生物学特性之间的关联。其他具有流形逼近的降维策略(例如 uMAP)可能解决了其中一些局限性,但是无法完全避免降维策略固有的信息损失。通常用完整的高维数据进行聚类识别。例如,使用 PhenoGraph 分析,基于大量不同人群的慢性 HIV 感染,肺癌和健康对照患者的衰竭指标进行分析,鉴定出 25 个高维 CD8 + T 细胞簇。这些细胞亚群通常投影到 tSNE 图中耗竭的离散区域,该图是使用相同的耗竭 marker 计算得出的,但也显示了从 tSNE 映射中不明显的群集隶属关系(图 2)。显然,这种基于耗竭 marker 的聚类方法还将识别功能性 T 细胞,例如 TN,TEFF 或 TMEM 细胞,但对于 TEX 子集的识别将具有更高的粒度(granularity)。

图 2. 使用质谱流式进行 TEX 表征的系统免疫学方法。 选择合适的能够通过诸如转录组或表观基因组图谱将 TEX 与 TEFF 和 TMEM 区别开来的耗竭 marker 是使用大规模细胞计数法进行 TEX 定向免疫图谱分析的关键步骤。 TEX 的高维分析提供了关于 TEX 异质性的进一步了解,而 TEX 的异质性可以被生物信息学揭示,包括细胞亚群识别和降维策略(即 tSNE,Phenograph),这些策略提供了耗竭状况的详细概述。 详细的 TEX 细胞亚群分析为了解 TEX 的异质性及其在不同疾病环境(例如慢性感染和癌症)中的参与提供了基础。

在严重的疾病情况下,例如在严重的 HIV 感染中,或者在肺癌患者的肿瘤微环境中,发现了一些 TEX 的细胞亚群。从表型上看,这些与疾病相关的 TEX 表现出耗竭的特定 marker(例如 PD-1,CD38)和高表达 Eomes 和 TOX 为特征,转录因子 TCF-1 低表达为特征的共表达现象(图 3)。有趣的是,慢性感染中与疾病相关的 TEX 的特征在于抑制受体 TIGIT 和 2B4(以及一些 KLRG1 和 CD160)的共表达,而在癌症中,TEX 更常表现出 CTLA-4,Lag-3,和 CD39。这些数据表明,在慢性感染和癌症中,TEX 细胞具有保守的生物学特性,但同时也突出了耗竭程序中的特定差异,可能与蛋白翻译过程具有更多相关性。例如,不同疾病之间甚至不同疾病阶段的 TEX 细胞亚群中,免疫调节分子的共表达模式会有所不同。表明联合免疫治疗的功效(即联合靶向 PD-1 和 CTLA-4 )可能会随着 TEX 细胞亚群的组成而有所不同。重要的是,并非功能衰竭的 T 细胞的所有亚型都随着疾病的进展而丰富。例如,与肿瘤组织相比,PD-1 表达和 CD127,TCF-1 和 CXCR5 共表达的子集在疾病控制相对较好的 HIV 患者(即高 CD4 计数,CD4 / CD8 比和低病毒载量)中富集,在未被肿瘤浸润的肺部癌旁组织中也大量检测到了这些 “健康相关” 的 TEX 细胞亚群。

图 3. TEX 异质性模型和连接到各个细胞亚群的关键 marker。在 TEX 分化中,TEX 子集有三个主要轨迹。早期的 TEX 可能引起疾病相关或健康相关的 TEX 集合,它们在激活程序和转录方面存在很大差异,而在这两个极端之间,可以观察到平衡的分化 TEX 集合。一种分化轨迹导致在疾病控制(“健康相关的 TEX”)中具有较高稳态潜力的种群,并且可以具有类似记忆的特征,例如高 TCF-1 和 CD127 表达。在 TEFF 细胞(例如 CD38,CD39)上也发现了激活 marker 的强表达以及许多抑制受体(IR)的共表达,这是在慢性感染和癌症的进行性疾病中鉴定出的 TEX 种群的关键特征。

通过使用质谱流式技术进行高维分析,确定的这些 TEX 亚群共表达抑制性受体与 HIV,HCV,HBV 慢性感染患者和黑色素瘤患者的癌症报道一致。疾病控制场景中表达 TCF-1 和 CD127 的表达的 TEX 具有更高的稳态(例如清除 HCV 感染)。此外,表达 CXCR5 的 TEX 与更好地控制 HIV 感染有关,并被认为是对检查点免疫疗法有反应的主要子集。具有较高 TCF-1 和 CXCR5 表达的耗竭的肿瘤浸润 T 细胞的前体群体也被确定与检查点封锁疗法后的较好临床结局有关。

因此,质谱流式技术非常适合于临床意义上的检测 TEX 的异质性。 图 3 和表 1 显示了 TEX 异质性模型,包括潜在的谱系关系以及通过质谱流式技术进行 TEX 分析所需的建议标记。
 

质谱流式对 TEX 分析:深入了解检查点治疗监测

TEX 逐渐成为成功的免疫检查点疗法的重要相关指标。在接受检查点疗法的患者的临床试验中,必须特别注意免疫谱分析,因为治疗性抗体和检测用抗体可能竞争同一表位。虽然建立了针对检查点试剂的二抗的组合染色,依然为生物信息学分析带来了挑战。此外,在质谱流式试验中经常用于细胞内 barcode 的瞬时通透性实验步骤,会减少抗 PD-1 染色。尽管存在这些挑战,质谱流式已成功应用于对 CD8 + T 细胞进行分析的多项研究中。与肿瘤相比,TEX 的恢复功能被认为是接受抗 PD-1 抗体检查点治疗的恶性黑色素瘤患者临床反应的主要相关因素。使用传统流式研究小细胞肺癌患者也观察到类似结果。在一项比较 PD-1 和 CTLA-4 检查点疗法的差异作用的研究中,发现 PD-1 阻断优先在 CD8 + TEX 个别亚群中诱导反应,而抗 CTLA-4 疗法引起 CD4 + T 细胞的更深刻变化。这些报告还强调了将 TEX 定向检测 panel 与针对其他免疫细胞群体的 marker 结合使用的实用性。需要对 TEX 细胞亚群的异质性进行更完善研究,更集中的针对耗竭程序的分析,以详细分析检查点治疗期间的 TEX 动力学以及联合治疗的个性化药物方法。
 

总结与展望

使用传统的表型分析方法无法将 TEX 与 TEFF 和 TMEM 区分开来,这是一个长期存在的问题,阻碍了对 TEX 在疾病中相关性的监测和理解。高维度的质谱流式技术有助于解决这一问题,推进了 TEX 的表征。TEX 的 marker 的组合信息能够区分 TEX 与 TEFF/TMEM,也为我们了解 TEX 的异质性提供了信息。质谱流式技术的另外一个优势--能够将 TEX 的高维度表达谱与功能谱的数据整合在一起,使得人类疾病中检测 TEX 亚群的精细表征成为可能。T 细胞激活相关的蛋白 marker 是许多 TEX 细胞群体与效应 T 细胞(如 CD38、CD39、PD-1)的共同特征,而稳态相关 marker 是 TEX 细胞群体(包括那些与疾病控制相关的)与记忆 T 细胞的共同特征。具有不同临床作用的异质 TEX 细胞亚群在人类慢性感染和癌症的几个转化环境中针对免疫检查点疗法,存在不同的反应性。

目前也有一些其他的策略,能够深入剖析耗竭 T 细胞群的异质性,如 scRNA-Seq 能够在单细胞的水平上分析 T 细胞转录组。然而,这些方法有一些比较明显的限制:1. 缺乏低表达量蛋白的高敏感性;2. 检测细胞数量稀少,无法鉴定稀有的细胞亚群;3. 缺乏有关蛋白质表达的信息,缺少潜在的转录后调控;4. 缺少 T 细胞功能性的检测。尚不清楚单个细胞水平上太大的 mRNA 转录物数据集是否会揭示 TEX 群体的更多相关异质性,因为 scRNA-Seq 的分析方法已被设计为最大化利用 TEX 和功能性 T 细胞亚群之间差异的信息标记。值得注意的是,通过质谱流式在免疫组分析过程中生成的高维数据的组合复杂性与其他组学方法不同。例如,怀孕期间进行质谱流式免疫分析以及转录组,微生物组,蛋白质组和代谢组分析的同时分析表明,基于模块化分析,与其他组学数据集相比,质谱流式数据集的信息量更大(根据占每个数据集 90%方差所需的主成分数量来衡量)。

迄今为止,对 TEX 最详细的剖析是在慢性感染或癌症的小鼠模型中进行的。随着质谱流式技术对人类 TEX 细胞异质性的详细解析,预计将会更详细地鉴定特定类型疾病和解剖位置相关的 TEX 特征,这将指导我们理解 TEX 细胞亚群在慢性感染、癌症甚至自身免疫中的变化。许多免疫调节通路中涉及的耗竭相关蛋白的表达数据也表明,TEX 特征分析可能是成功进行联合免疫疗法的必要条件。质谱流式技术可能是合理设计个性化治疗方法不可或缺的手段。

总而言之,质谱流式技术能够对 TEX 进行深度免疫分析,在癌症,病毒感染和自身免疫中对免疫疗法的发病机理和反应产生的过程中,针对 T 细胞分化的特殊阶段及其在发病机制和应答中的作用,提供进一步的了解。

原文:Front. Immunol., 22 January 2020 | https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.03039


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