达康书记的GDP由你守护，RNA的路径由我追踪——看那核酸往哪跑

成员如此复杂，事情如此之多，如何监管就是个大问题，鉴于它们都没有主动汇报的习惯，人类只能自己想办法，比如用基因芯片、 RT-PCR、荧光磁珠分选、高通量测序等，都能找出RNA的种类、数量、序列等。

但是，总觉得上述方法太暴力了，拿到组织和细胞就是一通研磨、破碎、裂解........  最后抓到RNA，虽然能够从头到脚看个仔细，但是它们原本在细胞内的位置和状态了就难以弄清了。

因此，一般比较推崇温柔一点的手段：不要破坏细胞，悄悄标记出RNA，然后用神器—荧光显微镜，观察RNA在细胞内的一举一动，悄悄欣赏，岁月静好...........

荧光蛋白标记

说到标记，有一个很好的榜样：GFP，作为蛋白质家族中最优秀的间谍，GFP跟踪目标的能力强，汇报及时。 可是，RNA家族中找不到这样的间谍，RNA不是天然的荧光素，也不能通过编码成荧光基团，幸好，歌者文明Singer和他伙伴们于1998年公布了一种方法[1]：

MS2蛋白是MS2噬菌体的包膜蛋白，可以与噬菌体复制酶上RNA的颈环序列特异结合，根据这一特点，将MS2与GFP融合，然后在目标mRNA 3‘端非翻译区加入颈环序列[2]，于是融合蛋白就可以与目标mRNA结合，通过荧光显示出来。

还可以在目标mRNA上加多个颈环以使标记信号更强。

Figure 1，酵母细胞中的ASH1 mRNA。  图片引自【1】

然而，这个方法有个小缺点：没有与RNA结合的融合蛋白也会发荧光，会产生背景，改善的方法是给融合蛋白加一个核定位序列，这样不结合的就定位在核内，只有与mRNA结合的才能被带到细胞质[3]。或者，用反卷积算法处理图像以减少背景。

Figure 2  Cos细胞中的mRNA活细胞成像。绿色，GFP；红色，MS2结合位点的原位杂交；蓝色，DAPI。 （B）MS2-GFP和 Reporte mRNA共表达。（C）只表达MS2-GFP。 图片引自【3】

除了MG2之外，还有其他的蛋白-RNA结合模式，比如Pumilio和FBF，以此可以实现多种mRNA的同时标记。[4,5]

既然蛋白质可以与RNA特定区域结合，那么有没有单独的荧光素可以与RNA结构特异结合呢？ 还真有，而且这类荧光素还有其独特优点：不结合目标的时候不发荧光[6,7]，  而且解离常数在纳摩尔水平，灵敏[8,9,10,11]。真是天生丽质......

Figure 3 图片引自【14】

而且这种荧光素也有很多种，分别有不同的颜色和不同的RNA结合区域[12,13]。

Figure 4  咪唑啉酮类（4-hydroxybenzlidene imidazolinone，HBI）活细胞标记RNA。A，HBI荧光基团结构式；B，DMHBI结合RNA前后后荧光变化； C，HEK293T细胞用DFHBI标记5S rRNA，加600mM蔗糖刺激后荧光分布随时间的变化，第一幅图为Hoechst染色显示细胞核。图片引自【13】

估计细心的同学已经发现了一个问题：前面提到的方法都需要目标RNA带有特定的序列，如果待检测的目标RNA不能导入特定序列怎么办？ 请喝口水接着往下看。

杂交探针标记

根据碱基配对原则，设计一小段与待测RNA序列互补的序列，加上荧光素作为探针，这样就可以检测任意序列了。如果想增强荧光亮度，可以在一条探针上多标记几个荧光素。或者把几个探针用链亲和素或聚乙二醇连接成多聚体。[15,16,17]

Figure 5 黑色的为杂交探针，红色的为待测RNA片段，图片引自【14】

然后，同样的问题又来了：未结合目标片段的探针也发荧光....... 请再喝口水接着往下看.......

常用的荧光淬灭分子对是 CAL Fluor Red 610和Iowa Black RQ (IBRQ)。当受到590nm光激发时，CAL Fluor Red 610发出波长为610nm的红色荧光，如果IBRQ在附近，就会接收CAL Fluor Red 610的能量，以热量的形式散发出去。

Figure 6-1（a）带有CAL Fluor Red 610-IBRQ分子对的分子信标MB，连接一个发800nm荧光的QD800量子点用以示踪，分别在没有结合目标RNA和结合目标RNA时的荧光变化示意图。（b）结合前后的荧光光谱变化。图片引自【19】

Figure 6-2（c）MB在MCF-7乳腺癌细胞中的荧光分布。   图片引自【19】

 MB的探针因为有颈环结构，会稍稍影响与目标片段的结合，导致标记效率和速度比直链的探针略低，于是Okamoto等报道了一种方法：

还是用直链探针，只是所连接的荧光素为两个靠近的花青素分子，形成非共价二聚体，发的荧光很弱，探针与目标片段结合之后，两个花青素分子分开，荧光大大增强。ECHO（Excitation-Controlled Hybridization sensitive Oligonucleotide）[22]

Figure 7 图片引自【14】

类似的还有Seitz等开发的方法，FIT（forced intercalation，强插？） 肽核酸探针：在探针的中间带有一个噻唑橙基团，当探针与目标片段结合后，噻唑橙基团的荧光显著增强。[20,21]

Figure 8，  FIT探针模式图，以H1N1流感病毒mRNA为目标构建，感染MDCK细胞后的荧光分布。     图片引自【20】

裸的RNA在细胞内容易被降解，因此需要修饰，比如对核糖核苷酸甲基化成为2’OMe RNA， 不仅能对抗核酸酶的降解，还提高了亲和力、特异性和杂交速度。

好了，介绍了这些标记方法，不知道是否对您的实验设计有所帮助呢？

每一种新的标记方法，就如同在黑夜中点亮一盏灯，照亮一片未知的领地，配合好的观察工具，揭示生命新的秘密。

参考文献

1. Bertrand E, Chartrand P, Schaefer M, Shenoy SM, Singer RH,Long RM: Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.Mol Cell 1998, 2:437-445.

2. Beckett D, Uhlenbeck O: Ribonucleoprotein complexes of R17 coat protein and a translational operator analog. J Mol Biol 1988, 204:927-938.

3. Fusco D, Accornero N, Lavoie B, Shenoy SM, Blanchard J-M,Singer RH, Bertrand B: Single mRNA molecules demonstrate probabilistic movement in living mammalian cells. Curr Biol 2003, 13:161-167.

4. Daigle N, Ellenberg J: lN-GFP: an RNA reporter system for livecell imaging. Nat Methods 2007, 4:633-636.

5. Ozawa T, Natori Y, Sato M, Umezawa Y: Imaging dynamics of endogenous mitochondrial RNA in single living cells. Nat Methods 2007, 4:413-419.

6. Simeonov A, Matsushita M, Juban EA, Thompson EHZ,Hoffman TZ, Beuscher AE IV, Taylor MJ, Wirsching P, Rettig W,McCusker JK et al.: Blue-fluorescent antibodies. Science 2000,290:307-313.

7. Szent-Gyorgyi C, Schmidt BF, Creeger Y, Fisher GW, Zakel KL,Adler S, Fitzpatrick JA, Woolford CA, Yan Q, Vasilev KV et al.: Fluorogen-activating single-chain antibodies for imaging cell surface proteins. Nat Biotechnol 2007, 26:235-240.

8. Babendure JR, Adams SR, Tsien RY: Aptamers switch on fluorescence of triphenylmethane dyes. J Am Chem Soc 2003,125:14716-14717.

9. Constantin T, Silva GL, Robertson KL, Hamilton TP, Fague KM, Waggoner AS, Armitage BA: Synthesis of new fluorogenic cyanine dyes and incorporation into RNA fluoromodules. Org Lett 2008, 10:1561-1564.

10. Sando S, Narita A, Hayami M, Aoyama Y: Transcription monitoring using fused RNA with a dye-binding light-up aptamer as a tag: a blue fluorescent RNA. Chem Commun 2008:3858-3860.

11. Sparano BA, Koide K: Fluorescent sensors for specific RNA: a general paradigm using chemistry and combinatorial biology. J Am Chem Soc 2007, 129:4785-4794.

12. Famulok M, Hartig JS, Mayer G: Functional aptamers and aptazymes in biotechnology, diagnostics, and therapy. Chem Rev 2007, 107:3715-3743.

13. Paige JS, Wu KY, Jaffrey SR: RNA mimics of green fluorescent protein. Science 2011, 333:642-646.

14. Bruce A Armitage, Alanna Schepartz and Ruben L Gonzalez, Jr.: Imaging of RNA in live cells. Current Opinion in Chemical Biology 2011, 15:806–812.

15. Raj A, Peskin CS, Tranchina D, Vargas DY, Tyagi S: Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol 2006,4:1707-1719.

16. Santangelo PJ, Lifland AW, Curt P, Sasaki Y, Bassell GJ,Lindquist ME, Crowe JEJ: Single molecule-sensitive probes for imaging RNA in live cells. Nat Methods 2009, 6:347-349.

17. Lifland AW, Zurla C, Santangelo PJ: Single molecule sensitive multivalent polyethylene glycol probes for RNA imaging. Bioconjug Chem 2010, 21:483-488.

18, Tyagi S, Kramer FR: Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nat Biotechnol 1996, 14:303-308.

19. Chen AK, Behlke MA, Tsourkas A: Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Res 2007, 35:e105.

20. Ko¨ hler O, Jarikote DV, Seitz O: Forced intercalation probes (FIT probes): thiazole orange as a fluorescent base in peptide nucleic acids for homogeneous single-nucleotidepolymorphism detection. ChemBioChem 2005, 6:69-77.

21． Kummer S, Knoll A, Socher E, Bethge L, Herrmann A, Seitz O: Fluorescence imaging of influenza H1N1 mRNA in living infected cells using single-chromophore FIT-PNAs. Angew Chem Int Ed 2011, 50:1931-1934.

22． Kubota T, Ikeda S, Yanagisawa H, Yuki M, Okamoto A: Sets of RNA repeated tags and hybridization-sensitive fluorescent probes for distinct images of RNA in a living cell. PLoS One 2010, 5:e13003.