反相高效液相色谱法测定尿液4种肾病标志物

分离效率和灵敏度较差，保守的分析方法的干扰因素较多。而采用的此法可在5min内同时测定糖尿病肾病尿样中的CnCrU和Ua这4种非蛋白氮代谢产物.此方法具有快速、需样量小、灵敏度高和重现性好的特点，完全可运用于临床上患者尿液的日常分析和早期肾病的监测。

流动相含30％(体积比)甲醇和10mmol/LpH6.86磷酸缓冲溶液，摘要】目的建立糖尿病患者尿液中与肾病相关的非蛋白氮代谢产物(肌酸、肌酐、尿素和尿酸)反相高效液相色谱分离分析方法.方法：采用AgilentC18200mm4.6mm内径5μm色谱柱。流速0.9mL/min检测波长200nm柱温为室温.结果：5min内可对患者尿液中上述4种物质同时进行测定，样品前处理简单，重现性较好(迁移时间和峰面积的RSD均≤3%线性范围较宽（肌酸：5~300μmol/L肌酐：10~200μmol/L尿素：1~30mmol/L尿酸：10~1500μmol/L.结论：此法完全适用于临床上患者尿液的日常分析和早期肾病的监测。

关键词】反相高效液相色谱；糖尿病肾病；非蛋白氮；尿样

引言

已引起了人们广泛关注.非蛋白氮代谢产物如肌酸(creatinCr肌酐(creatininCn尿素(ureaU和尿酸(uricacidUa即是与DN相关的几种物质.已报道的有关这些物质的分离分析方法主要有比色法［1］、酶法［2］、液相色谱法［3-6］、毛细管电泳法［7-9］等.其中比色法和酶法通常只能测定单一的物质，糖尿病并发肾病（diabeticnephropathiDN糖尿病患者致死的重要原因之一。而且尿液中的一些内源性物质对测定有干扰；液相色谱法则多集中在对某一种或部分物质的测定上；毛细管电泳测定这些标志物重现性有待于提高.运用反相高效液相色谱法，对DN患者尿液中与DN相关的CrCnU和Ua这4种非蛋白氮代谢产物进行同时分离检测.同时测定尿液中的4种物质目前还未见报道.此法具有快速、灵敏度高和重现性好的特点，完全可运用于临床上患者尿液的日常分析和早期肾病的监测.

1资料和方法

水为二次重蒸水1.1资料Agilent1100液相色谱仪（美国Agilent公司）CrCnUa均购自Sigma公司（USASigma甲醇为色谱纯试剂（天津第二化学试剂厂）其余试剂均为分析纯。.

1.2方法

等度洗脱，1.2.1色谱条件色谱柱为AgilentC18柱（200mm4.6mm内径5μm流动相含体积比为30%甲醇和10mmol/LpH6.86磷酸缓冲溶液。流速0.9mL/min检测波长200nm柱温为室温，进样量为10μL.

溶解在40mL重蒸水中，1.2.2规范溶液的配置和尿样的处置方法CrCn和U规范溶液均使用二次重蒸水配置成一定的浓度.Ua溶液的配置方法如下：取30mg磷酸钾。加热至60℃，使其完全溶解，精确称取Ua28mg溶解于热磷酸钾溶液中，冷却至室温，移入100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，贮存在棕色瓶中保存.尿液样品的处置方法：取新鲜的尿液用水稀释1倍后待用.所有溶液每周更换1次，使用前均过0.45μm水相膜后再用于色谱分析.

2结果

分别改变缓冲液的pH值、流动相（pH6.86中甲醇比例、流动相中缓冲液浓度和流动相的流速，2.1色谱条件的优化固定其它色谱条件不变。考察了其对4种物质分离的影响。

连续5次测定了同一样品，2.2方法重现性在选定的色谱条件下。对各物质的迁移时间、峰面积和峰高的重现性进行了考察，结果标明，各物质的迁移时间的变化很小（保管时间的RSD值见表1方法的重现性较好。

按上述色谱条件进行分析测定，2.3定量规范曲线、回收率以及最低检测限配置一系列浓度的规范溶液。将所测的峰面积对物质的浓度作回归分析，其线性相关系数均大于0.9992以信噪比(S/N为3来测定检测限；

对规范溶液和实际DN尿样进行了分析，2.4样品分析在选定的色谱条件下。5min内4种物质即可达到完全分离，分离结果如图3所示，实际DN尿样中的4种物质得到很好的检出，尿样里的其他物质对分析无干扰.采用此法对某糖尿病患者以及正常人尿样中的CnCrUUa分别进行测定，结果糖尿病患者尿样中CnCrUUa含量分别为10.30.6826.72.1μmol/mL正常人尿样中的CnUUa含量分别为7.736.71.0μmol/mL而Cr未被检出。

3讨论

pH3.5~7.5范围内U和Cr出峰时间和顺序几乎不随pH变化而变化；而对于Cn和Ua来说，3.1pH对分离的影响其从图1A中可以看出。其出峰时间和顺序都随pH变化而变化，当pH接近5.5时，两者的出峰时间近乎相同，得不到分离.因此，选择最佳pH时，主要考虑Cn和Ua之间的分离度（Rs以及分析的效率（分析周期短）最终选择缓冲能力最强，分离度较佳（Rs＝4.1pH6.86为优化的分离pH

随着流动相中甲醇比例的增加，3.2流动相中甲醇比例的选择从图1B中可以看出。各标志物的出峰时间随之减少，分离周期大大缩短，但与此同时各标志物间的分离度也相应减少，当流动相中甲醇的比例大于40％时，各物质几乎同时被洗脱出来，难以达到分离.最终选择流动相中甲醇含量为30％为较佳的比例（此时分析周期较短，各物质间分离度均大于2.0

随着缓冲液浓度的增加，3.3流动相中缓冲液浓度对分离的影响从图2A中可以看出。各标志物的峰面积随之减小.而缓冲液浓度为5和10mmol/L时峰面积比较接近，最终选择缓冲能力较强的10mmol/L为最佳缓冲液浓度。

各物质间的分离度是逐渐增加的并且分析周期变短；而当流速从0.9mL/min增加到1.0mL/min后，3.4当流速从0.4mL/min增加到0.9mL/min时。虽然分析效率有所提高（分离周期从4.8min减少到4.0min但各物质间的分离度却有所减小（此时的柱压也过高：93.1bar.最终选择0.9mL/min为最佳流速。

CnCr和Ua糖尿病患者尿样中的含量高于正常人（患者尿样中Cr含量远远高于正常人尿液中Cr含量）而患者尿样中U含量反而有所降低.这些都说明患者肾功能已经出现异常，3.5测定结果的分析从某糖尿病患者以及正常人尿样测定的结果可以看出。非蛋白氮代谢产物不能很好的排出体外（对Cr排泄率增加，而U排泄率降低）这也从一个侧面证实了患者的肾脏已经有了一定水平的损坏。