高效液相色谱法测定畜禽肉中土霉素、四环素、金霉素残留量

1.实验目的

据标准GB/T14931.1-94测定畜禽肉中土霉素、四环素、金霉素残留量。最低检出浓度为：0.15，0.20，0.65mg/kg。

2.试验原理

　　样品经提取，微孔滤膜过滤后直接进样，用反相液相色谱分离，紫外检测器检测，与标准比较定量，出峰顺序为土霉素、四环素、金霉素。标准加法定量。

3.试剂

3.1　乙腈（分析纯）。

3.2　0.01mol/L磷酸二氢钠溶液：称取1.56 g（±0.01g）磷酸二氢钠（NaH₂PH₄.2H₂O）溶于蒸馏水中，定容到100 mL，经过滤器过滤（选用微孔滤膜为0.45 μm），备用。

3.3　土霉素（OTC）标准溶液：称取土霉素0.0100g（±0.0001g），用0.1mol/L盐酸溶液每毫升含土霉素1mg。

3.4　四环素（TC）标准溶液：称取四环素0.0100g（±0.001g），用0.01mol/L盐酸溶液溶解并定容10.00 mL，此溶液每毫升含四环素1mg。

3.5　金霉素（CTC）标准溶液：称取金霉素0.0100g（±0.0001g），溶于蒸馏水并定容成10.00mL，此溶液每毫升含金霉素1mg。以上标准品均按1000单位/mg折算。3.3～3.5溶液应于4℃以下保存，可使用1周。

3.6　混合标准溶液：取3.3、3.4标准溶液各1.00mL，取3.5标准溶液2.00mL，置于10mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度。此溶液每毫升含土霉素、四环素各0.1mg，金霉素0.2mg，临时现配。

3.7　5％高氯酸溶液。

4.仪器

4.1       高效液相色谱仪（HPLC）：具紫外检测器。

4.2       振荡器：天津市恒奥科技发展有限公司

4.3       过滤器：天津市恒奥科技发展有限公司

4.4       超声波：天津市恒奥科技发展有限公司

5.色谱条件

5.1　液相色谱柱：ODS-C18 （5 μm）　6.2mm×15 cm。

5.2　检测波长：355nm。

5.3　灵敏度：0.002AUFS。

5.4　柱温：室温。

5.5　流速：1.0mL/min。

5.6　进样量：10 μL。

5.7　流动相：乙腈/0.01mol/L磷酸二氢钠溶液（用30％（V/V）硝酸溶液调节pH2.5），35：65（V/V），使用前用超声波脱气10min。

6.操作方法

6.1　样品测定：称取5.00 g（±0.01 g）切碎的肉样（＜5 mm），置于50mL锥形烧瓶中，加入5％高氯酸25.0mL，于振荡器上振荡提取10min，移入到离心管中，以2000 r/min离心3min，取上清液经0.45μm滤膜过滤，取溶液10μL进样，记录峰高，从工作曲线上查得含量。

6.2　工作曲线：分别称取7份切碎的肉样，每份5.00 g（±0.01 g），分别加入混合标准溶液0、25、50、100、150、200、250 μL（含土霉素、四环素各为0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 μg， 含金霉素0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 μg）， 按6.1方法操作，以峰高为纵坐标，以抗生素含量为横坐标，绘制工作曲线。