气相色谱法测定生物样品中β-榄香烯

β-榄香烯(β-elemene)是从中药温莪术(C.wenyujin Chen.etC.Ling)根茎中提得的有效单体［1］，具有抗肿瘤作用［2］。国内外未见对生物体液中β-榄香烯测定方法报道。我们首次建立了用气相色谱法分离并测定生物样品中β-榄香烯的方法，并用该法研究了本品在动物体内的生理处置(待发表)。
1　材料与方法
1.1　药品与试剂　β-榄香烯标准品，纯度98.8 %，1 %β-榄香烯乳剂，批号940828，均由中国科技开发院医药科技开发所馈赠；正十三烷，色谱纯，中科院大连化学物理研究所馈赠；乙醚：上海马陆制药厂，分析纯；二硫化碳，沈阳化学试剂厂，分析纯。
1.2　动物　Wistar 大鼠，♂，体重：(180±5) g，由大连医科大学实验动物中心提供。
1.3　仪器　Shimadzu GC-7AG型气相色谱仪，氢火焰离子化检测器(FID)，ChromatopacC-R2A型数据处理机；GCD—300B氢气发生器(北京中国惠普分析技术研究所)。
1.4　色谱条件　毛细管色谱柱：不锈钢柱（2.1m×3 mm），固定相：5 % SE—30/Gas Chrom Q 80～100目；柱温：115 ℃，气化室温度210℃，检测器：FID；气体流速：高纯N2 30 mL/min，H2 40 mL/min，Air 400mL/min；量程：10；衰减：23；纸速：2.5 mm/min，进样量2 μL。
1.5　标准液配制　准确称量β-榄香烯标准品50 mg，置于100 mL容量瓶内，用二硫化碳定容至刻度，摇匀，即得0.05%β-榄香烯母液。准确量取β-榄香烯母液10 mL，置于50 mL容量瓶内，用二硫化碳定容至刻度，摇匀，即得0.01%β-榄香烯工作液。母液及工作液密封，-4 ℃保存。
1.6　内标液的配制　准确称量正十三烷350 mg，置100 mL容量瓶内，用二硫化碳定容至刻度，摇匀，得0.35%内标母液。准确量取内标母液10 mL，置50 mL容量瓶内，用二硫化碳定容至刻度，摇匀，得0.07%内标工作液。母液及工作液密封后，-4 ℃保存。
1.7　生物样品制备　取大鼠血浆、粪匀浆(1∶20)、胆汁各1 mL，分别加入内标工作液10 μL，饱和氯化钠溶液3滴，0.1mol/L氢氧化钠溶液200 μL，混匀后室温下静置5 min，乙醚提取(2 mL×2)，旋涡混合30s，离心(3000r/min,10min)，合并乙醚提取液，35 ℃恒温水浴下挥干，残留物用100 μL二硫化碳溶解，进样2μL测定。
2　生物样品标准曲线及回收率
取大鼠空白血浆、粪匀浆、胆汁各1 mL，分别置于玻璃离心试管内，各加入内标工作液10μL，β-榄香烯工作液2、4、6、10、20、40、80 μL，按上述生物样品制备方法操作，冰浴下定容100 μL，进样2μL。以β-榄香烯与内标物峰面积比(As/Ai，Y)对β-榄香烯浓度(X)直线回归，结果表明各生物样品标准曲线均通过原点，在0.1～4.0μg/mL范围内线性关系良好。由各生物样品标准曲线各点峰面积与绝对标准曲线对应点的峰面积比值计算回收率，各样品的回收率在97.50%～99.16 %之间(表1)。

表1　生物样品回归方程及回收率(n＝3)



生物样品
回归方程
r
回收率
±S/%

血　浆
Y＝0.5240X+0.0123
0.9999
99.16±1.6

粪匀浆
Y＝0.5372X+0.0042
0.9998
98.64±4.6

胆　汁
Y＝0.5260X+0.0056
0.9998
97.50±3.4


3　精密度
配制不同浓度的β-榄香烯生物样品，作日内、日间精密度实验。各生物样品As/Ai的RSD均小于10 %(表2、3)。方法的最低检测限为2ng/2 μL(S/N=2)，相当于0.1 μg/mL血浆。

表2　生物样品日内精密度(n＝5)


浓度/
(μg/mL)
RSD/%

血浆
粪匀浆
胆汁

0.1
8.39
8.24
8.73

1.0
3.99
5.72
4.24

4.0
2.60
3.14
2.07


4　方法特异性
大鼠iv β-榄香烯乳75mg/kg后，分别制备血浆、粪匀浆及胆汁样品进行测定。结果表明，内标物与β-榄香烯的tR分别为8.4、13.3min，与标准品一致，二者分离良好，且不受生物样品中杂质干扰，表明各生物样品中的被测物即为β-榄香烯原形药(图1～3)。

表3　生物样品日间精密度(n＝5)





浓度/
(μg/mL)
RSD/%

血浆
粪匀浆
胆汁

0.1
5.95
9.99
8.03

1.0
7.98
7.96
6.16

4.0
2.20
6.41
5.75


图1　大鼠空白血浆(A)、空白血浆+内标+β-榄香烯
标准品(B)、大鼠iv β-榄香烯后血浆(C)的色谱图
1.内标物　2.β-榄香烯





图2　大鼠空白胆汁(A)、空白胆汁+内标+β-榄香烯
标准品(B)、大鼠iv β-榄香烯后胆汁(C)的色谱图
1.内标物　2.β-榄香烯　3.未知物Ⅰ







图3　大鼠空白粪匀浆(A)、空白粪匀浆+内标+β-榄香
烯标准品(B)、大鼠iv β-榄香烯后粪匀浆(C)的色谱图
1.内标物　2.β-榄香烯　3.未知物Ⅱ　4.未知物Ⅲ

5　讨论
本文在国内外首次建立了用气相色谱法分离并测定生物样品中β-榄香烯的方法。实验中曾选用乙醇、环己烷作定容剂，但均出现保留时间长，峰形宽大，拖尾严重而影响测定，后选用二硫化碳作为定容剂，响应值小，出峰快，峰形窄，避免了因溶剂峰过宽而影响测定，并缩短了测定时间，提高了灵敏度及工作效率。血浆样品中加入饱和氯化钠，可增加极性，减少乳化，提高回收率；加入氢氧化钠则消除了血浆中易在气相色谱中出峰的有机酸类杂质，减少其对测定的干扰。该法简便，灵敏，重现性及特异性强，能满足动力学研究的需要(已用该法研究了β-榄香烯在动物体内的药代动力学及生理处置，待发表)。

参考文献
1　　郭永等.温莪术挥发油中榄香烯的分离与鉴定.中药通报，1983,8：31
2　　傅乃武.β-榄香烯的抗肿瘤作用及药理学研究.中药通报，1984,9：35